序言：寫(xiě)作是分享個(gè)人見(jiàn)解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的離職感謝信樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。

第1篇

你好！你好！

首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感謝！首先，公司代表全休同仁衷心向你和你的家人表示感謝！感謝你在公司任職期間的兢表示感謝兢業(yè)業(yè)、默默奉獻(xiàn)！感謝你對(duì)____的認(rèn)可與信賴！感謝你對(duì)____的忠誠(chéng)和敬業(yè)！感兢業(yè)業(yè)、默默奉獻(xiàn)！的認(rèn)可與信賴！的忠誠(chéng)和敬業(yè)！付出的辛勤和汗水！謝你對(duì)____付出的辛勤和汗水！

可能是因?yàn)楣酒脚_(tái)及發(fā)展方向與你個(gè)人對(duì)未來(lái)規(guī)劃暫時(shí)不能保持一致，可能是因?yàn)楣酒脚_(tái)及發(fā)展方向與你個(gè)人對(duì)未來(lái)規(guī)劃暫時(shí)不能保持一致，而讓你選擇離開(kāi)你曾為之奮斗的工作崗位。但是我們相信，離開(kāi)你曾為之奮斗的工作崗位。但是我們相信，在____這些日子的成長(zhǎng)能讓你比昨天更自信、朋友更多、笑容更美！在未來(lái)的日子里，因?yàn)槟愕呐ζ床?、自信、朋友更多、笑容更美！在未?lái)的日子里，因?yàn)槟愕呐ζ床?、踏?shí)肯干的精神讓你在任何崗位都能成就不平凡的事業(yè)，無(wú)論是在工作中或生活中，你都是最優(yōu)秀的！在任何崗位都能成就不平凡的事業(yè)，無(wú)論是在工作中或生活中，你都是最優(yōu)秀的！

作中或生活中優(yōu)秀員工是企業(yè)的財(cái)富，當(dāng)你決定離開(kāi)時(shí)，我們的心里都有一種說(shuō)不出的感受-----優(yōu)秀員工是企業(yè)的財(cái)富，當(dāng)你決定離開(kāi)時(shí)，我們的心里都有一種說(shuō)不出的感受-----是遺憾！是惋惜！是祝福！但是天下沒(méi)有不散的筵席，我們衷心祝福你：家庭和睦，是遺憾！是惋惜！是祝福！但是天下沒(méi)有不散的筵席，我們衷心祝福你：家庭和睦，健康幸福！同時(shí)請(qǐng)你記住：公司全體伙伴非常高興地歡迎你有時(shí)間?；丶铱纯?，幸福！同時(shí)請(qǐng)你記?。汗救w伙伴非常高興地歡迎你有時(shí)間常回家看看，希望你能把當(dāng)成你永遠(yuǎn)的“娘家”____當(dāng)成你永遠(yuǎn)的“娘家”！

再次向你和你的家人表示真摯的感謝和深深的祝福！再次向你和你的家人表示真摯的感謝和深深的祝福！此致敬禮

你好！

你在公司服務(wù)整整一年，一年，就漫長(zhǎng)的人類世界來(lái)說(shuō)，也許只是短暫的一瞬，但就個(gè)人而言，也算不短的歲月。

在你提出離職的那一刻，我有種酸酸的感覺(jué)，畢竟，我不只一次跟你們說(shuō)，大家一起努力，共同退休。

但你因?yàn)閭€(gè)人發(fā)展，在勞動(dòng)合同到期的那一天，選擇離開(kāi)服務(wù)過(guò)365天的瀟湘文化，真有一種說(shuō)不出的滋味。

就設(shè)計(jì)能力而言，你并不占優(yōu)勢(shì)，但你忠厚坦誠(chéng)、任勞任怨，在這物欲橫流的社會(huì)，是難得的美德。所以，我一直非常喜歡你。

不知你以后會(huì)做些什么，希望以你的美德去感染更多愿意支持與幫助你的人，焉知，人格魅力才是人生發(fā)展最大的銳器。

你已經(jīng)離開(kāi)公司了，我將這封遲到的感謝信發(fā)給你哥哥，希望他轉(zhuǎn)交給你，真誠(chéng)感謝你為公司所做的艱辛付出，瀟湘文化永遠(yuǎn)不會(huì)忘記你的功勞。方便的時(shí)候，?；亍凹摇笨纯?。

謹(jǐn)祝

事業(yè)有成、幸福平安！

小__：

當(dāng)?shù)弥阌捎谥T多的個(gè)人原因不得不選擇離開(kāi)公司時(shí)，做為總經(jīng)理，我心里有一種說(shuō)不清的感受——是遺憾，是惋惜，是祝福？我想三者都有！

做為一名老員工，你在公司工作了三年半，伴隨著企業(yè)走過(guò)了許多風(fēng)雨。三年半來(lái)，你從一名普通員工成長(zhǎng)為一名稱職的基層管理人員和優(yōu)秀員工，這里面有企業(yè)為你創(chuàng)造的條件和機(jī)會(huì)，更有你自己辛勤的努力和付出。為什么能從一名普通員工成長(zhǎng)為優(yōu)秀員工？正如你說(shuō)的那樣：“每天都想著把每一件事做好，認(rèn)真關(guān)注每一個(gè)細(xì)節(jié)”，承擔(dān)責(zé)任，默默地為企業(yè)奉獻(xiàn)。在此，我代表公司向你致以誠(chéng)摯的謝意！感謝你對(duì)企業(yè)的認(rèn)可和信賴！感謝你對(duì)企業(yè)的忠誠(chéng)和敬業(yè)！感謝你為企業(yè)付出的辛勞和汗水！感謝你讓自己的青春在××公司閃光！

第2篇

大家好!今天我懷著依依不舍的心情寫(xiě)下這封信，俗話說(shuō)：人生沒(méi)有不散的宴席。今天選擇離開(kāi)這個(gè)我生活與工作了五年的地方，并不是因?yàn)楣窘o予我的太少，也不是待遇問(wèn)題?；仡櫸迥?，公司給予我的實(shí)在是太多太多，自己在公司也盡了自己微薄的力量。選擇離開(kāi)是覺(jué)得在公司這個(gè)美好的平臺(tái)上，自己就像是溫室里的花朵，必須到外面經(jīng)歷風(fēng)雨才能茁壯成長(zhǎng)，也許會(huì)碰得頭破血流，但也是人生中的一段精彩的回憶。

首先非常感謝公司給了我一個(gè)很好的工作平臺(tái)，以及在職的五年里對(duì)我的栽培和關(guān)懷，讓我在任何時(shí)候內(nèi)心都洋溢著感激之情，我從畢業(yè)來(lái)到新邦，作為新邦發(fā)展壯大的見(jiàn)證人，內(nèi)心無(wú)比的驕傲，一路走來(lái)，收獲了太多太多，都是新邦給我的，但是由于個(gè)人原因，不能為公司輝煌的明天繼續(xù)貢獻(xiàn)自己微薄的力量，為此感到深深的歉意。

在職的這些時(shí)間里，我從一個(gè)懵懂少年學(xué)會(huì)了物流的專業(yè)知識(shí)，學(xué)會(huì)了客戶談判、學(xué)會(huì)了管理技能，公司給予了我實(shí)現(xiàn)自身價(jià)值的機(jī)會(huì)，使我不斷的成長(zhǎng)，積累了工作的經(jīng)驗(yàn)，學(xué)會(huì)了為人處世的道理，所有的這些都是我所珍惜的，帶給我工作和生活中很大的幫助，感恩新邦，感謝石總、感謝袁總、感謝楊總、感謝程總、感謝艾總、感謝梁總、感謝呂總，感謝所有幫助與支持過(guò)我的同事和朋友。

在新邦的日子是充實(shí)而且快樂(lè)的，與優(yōu)秀的新邦人成為同事，一起共事，讓我受益匪淺，并且也將深深的影響我，我誠(chéng)摯的感謝大家，因?yàn)槟銈冏屛页砷L(zhǎng)，成熟，在朝夕相處的時(shí)間里建立的深深的友誼，是我一輩子的財(cái)富。

千言萬(wàn)語(yǔ)還是一句感謝，感謝過(guò)去的五年新邦給予我的栽培，感謝領(lǐng)導(dǎo)給我的幫助，感謝同事給我的支持。衷心的祝福公司的規(guī)模不斷的擴(kuò)大，業(yè)績(jī)不斷的提升，祝愿公司領(lǐng)導(dǎo)以及各位同事工作順利，生活愉快!

第3篇

說(shuō)來(lái)也奇怪，每個(gè)月我拿到雜志的第一件事，不是像其他同學(xué)一樣先看笑話或是美文，而總是一本正經(jīng)地研究起“封面人物”來(lái)，順便把自己和他們作一番比較：這個(gè)姑娘腿好長(zhǎng)，我也是大長(zhǎng)腿呀；這個(gè)姑娘好美，我的顏值也能入大家法眼吧；這個(gè)帥哥成績(jī)真好，我的成績(jī)也不賴……不知道為什么，對(duì)于封面人物，我總是有一種既佩服又不服的心理。

直到某期封面上刊登了一個(gè)我們衢州的姑娘時(shí)，我第一次有一種原來(lái)自己離封面人物那么近的感覺(jué)。我終于按捺不住內(nèi)心的“洪荒之力”，鼓起勇氣把自己的照片放上了銳角網(wǎng)。

頭幾天，每天回家我都會(huì)打開(kāi)電腦，看看有沒(méi)有人評(píng)論?！皠傞_(kāi)始看的人不多，很正常?！蔽疫@樣安慰自己。又過(guò)了幾天，有消息提示跳出來(lái)，我心里一陣狂喜，是不是有人來(lái)為我加油了，還是小編看到我了？我迫不及待地點(diǎn)開(kāi)了頁(yè)面，回復(fù)不多，當(dāng)中卻夾雜著好幾條負(fù)面評(píng)論。我的心情一下子從云端墜入了谷底。雖說(shuō)“勝敗乃兵家常事”，但我還是有一些失落。從那之后，我便沒(méi)有登錄過(guò)銳角網(wǎng)了。

直到有一天。“儂儂，你把照片放到網(wǎng)上去了？”媽媽接完一個(gè)電話后疑惑地問(wèn)我，“《中學(xué)生天地》的編輯說(shuō)你成功入選封面人物了，這是不是真的？”

真的真的！我激動(dòng)極了，趕緊跟爸媽解釋這件事情的前因后果，媽媽終于相信了她女兒的魅力，還神神秘秘地跟我說(shuō)了件事，可把我逗樂(lè)了――原來(lái)《中學(xué)生天地》的編輯在打電話之前就發(fā)過(guò)一條短信，但謹(jǐn)慎的媽媽竟然直接把它當(dāng)成了詐騙短信。而我爸爸是個(gè)特別愛(ài)N瑟而且自戀的人，這一點(diǎn)我可能有點(diǎn)隨他。他的反應(yīng)與媽媽完全不同，簡(jiǎn)直是高興得不要不要的，就差沒(méi)當(dāng)天晚上就把我送去拍照了。

拍攝那天是1月31日，日子我記得很清楚，因?yàn)槟翘靹偤靡彩俏野四昙?jí)上的休業(yè)式，我果斷跟老師請(qǐng)了假，老師也果斷準(zhǔn)了。

一路上我都特別悠閑自在地躺在車(chē)后座，還瞇了一小會(huì)兒，然而快到拍攝的地方時(shí)，我突然開(kāi)始坐立不安了。攝影師朝我走過(guò)來(lái)的時(shí)候，是我最最緊張的時(shí)刻。他先是笑著的，然后突然皺起了眉頭，短短的一兩秒鐘，我卻覺(jué)得特別漫長(zhǎng)，然后就聽(tīng)到他十分憂傷地說(shuō)：“你怎么那么高??？你媽媽說(shuō)你只有1米55呀，哎呀，那我買(mǎi)的衣服你穿不下怎么辦？”后來(lái)才知道，他這么說(shuō)只是為了緩解我的緊張。攝影師的形象瞬間從“高冷藝術(shù)家”直接降到了“嘮叨歐吉?！?。

那天，天特別冷（回家的路上還下起了雪），而我要穿著和三月號(hào)封面相符的春天的衣服，在凜冽寒風(fēng)中，擺出各種pose，臉上表情還不能太僵硬。雖然我很機(jī)智地在身上貼了好幾個(gè)暖寶寶，但還是要靠跺腳和搓手來(lái)取暖，瞬間有點(diǎn)同情起大冬天走紅毯的女明星們。

剛開(kāi)始拍攝的時(shí)候還有點(diǎn)緊張，手不知道該怎么擺，眼睛不知道該看哪兒，不過(guò)攝影師叔叔很專業(yè)，他一直在調(diào)動(dòng)我的情緒，還親自示范擺姿勢(shì)。拍著拍著，攝影師突然跟我說(shuō)：“好的，很好，你把剛才的動(dòng)作再做一遍?！毕乱幻?，大家就都笑趴在了地上――我以為攝影師要我半瞇著眼去看放大鏡，還想這么丑的表情真的好看嗎。據(jù)我媽媽的描述，當(dāng)時(shí)的畫(huà)面就像是一個(gè)中年大叔很努力地把眼睛瞇起來(lái)，要看清楚路邊的美女一樣，特猥瑣。一陣笑聲過(guò)后，我變得放松多了。

那期雜志社策劃的選題是“教室里的福爾摩斯”，衣服的搭配很有名偵探范兒，特別酷。后來(lái)又換了一套紅黑格子裙，化妝師姐姐還幫我換了一個(gè)發(fā)型，我可算是好好地過(guò)了一把模特癮！

每一時(shí)間點(diǎn)都巧合地讓“上封面”這件事給我留下難以磨滅的印象，就像是休業(yè)式那天請(qǐng)假去拍攝，又比如期中考試出成績(jī)的那天拿到了三月號(hào)雜志。

第4篇

你們好!

凝聚歲月，四個(gè)月多的頂崗支教實(shí)習(xí)時(shí)間悄然從指間劃過(guò)如白駒過(guò)隙。初來(lái)時(shí)，還是咋暖還寒的二月，可離別之時(shí)已是烈日炎炎的六月。至此，回想起來(lái)這一切的一切就好像是昨天剛發(fā)生的事一樣。

回望當(dāng)時(shí)來(lái)XX中學(xué)時(shí)，一切都是未知的，對(duì)自己將來(lái)在這里一學(xué)期的生活、工作具體那么多的不確定。擔(dān)心不能很好地適應(yīng)智力的高中生活;擔(dān)心學(xué)校不會(huì)給我們安排上課以及自己生活上的問(wèn)題，總之一切的一切都處在擔(dān)心之中。后來(lái)證明我們擔(dān)心地這一切都不從在。雖然達(dá)到時(shí)是寒冷的二月，但到達(dá)XX一后，就有老師帶領(lǐng)去熟悉宿舍以及我們的生活問(wèn)題也得到了解決，可以說(shuō)初來(lái)時(shí)的一切都很順利，也讓我們感到溫暖。

接著給我們介紹了兩位指導(dǎo)老師，也就是我的兩位師父，劉老師與郝老師。雖然第一次見(jiàn)面，但總覺(jué)得我的師父是那么的和藹可親。劉老師是一個(gè)細(xì)心的人不僅僅對(duì)我的教學(xué)進(jìn)行指導(dǎo)，更是對(duì)我們的生活無(wú)微不至的關(guān)懷。郝老師是一位知識(shí)淵博，有幽默感的老師。總之，這四個(gè)多月的實(shí)習(xí)過(guò)程中兩位師父總是不忘關(guān)心我們?cè)谏町?dāng)中有什么難處。除此之外，剛開(kāi)始以為我們是實(shí)習(xí)老師，辦公室里的其他老師會(huì)冷漠我們，可事實(shí)剛好相反，辦公室里的老師非常友好，而且他們也多次地幫助我們。再次，只能用自己綿薄的語(yǔ)言給他們說(shuō)一聲謝謝。

第5篇

【關(guān)鍵詞】 產(chǎn)后出血；子宮摘除；護(hù)理；心理干預(yù)

【中圖分類號(hào)】R635 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B 【文章編號(hào)】1005-0515(2011)06-0115-01

胎兒娩出后24小時(shí)內(nèi)出血量超過(guò)500ml者稱產(chǎn)后出血。產(chǎn)后出血是分娩晚期嚴(yán)重并發(fā)癥，至今仍居我國(guó)孕產(chǎn)婦死亡原因的首位[1]。對(duì)產(chǎn)科不可控制的出血，適時(shí)切除子宮是搶救產(chǎn)婦生命最重要的手段，但對(duì)產(chǎn)婦的心理健康會(huì)有一定的影響，應(yīng)積極的進(jìn)行心理干預(yù)和支持。現(xiàn)將我院2010年收住的一名患者因產(chǎn)后出血經(jīng)各種方法處理無(wú)效，最后行子宮切除的病例進(jìn)行回顧性分析，患者經(jīng)術(shù)中、術(shù)后心理干預(yù)措施和積極有效護(hù)理獲得痊愈，現(xiàn)將護(hù)理體會(huì)報(bào)告如下。

1 臨床資料

1.1一般資料：患者：女，28歲，經(jīng)產(chǎn)婦，兩年前產(chǎn)一子，剖宮產(chǎn)。今孕周39周，胎兒巨大，5.3kg，宮縮乏力。

1.2 手術(shù)方式：剖宮產(chǎn)術(shù)后即行子宮切除術(shù)。

1.3 出血量及輸血量：手術(shù)出血量2000毫升，輸血1600毫升。

1.4 結(jié)果：住院13天，切口愈合良好，痊愈出院。

2 護(hù)理

2.1 搶救與護(hù)理:產(chǎn)后出血會(huì)在短時(shí)間內(nèi)失去大量血液，造成產(chǎn)婦血容量不足，迅速進(jìn)入休克、DIC，甚至發(fā)生不可逆的器質(zhì)性損害，所以搶救必須爭(zhēng)分奪秒。

2.1.1 建立靜脈通道:積極配合醫(yī)生快速建立靜脈輸液通道3條，以便輸液、輸血。靜脈穿刺選擇20號(hào)針頭(用三通管套管針)。給予輸液輸血，補(bǔ)充血容量，力爭(zhēng)在1～4小時(shí)改善微循環(huán)，保證重要器官的供血，補(bǔ)充凝血因子，防治DIC。

2.1.2 防止腦缺氧:產(chǎn)婦取平臥位，保證腦部供血，正壓輸氧，減輕腦水腫，防止腦缺氧。保持呼吸道通暢，做好口腔護(hù)理，預(yù)防呼吸道感染。

2.1.3 持續(xù)監(jiān)測(cè)產(chǎn)婦的生命體征，測(cè)定中心靜脈壓，指導(dǎo)輸液。

在止血及補(bǔ)充血容量的同時(shí)，積極查找出血原因，正確使用宮縮劑，及時(shí)給予止血藥物，根據(jù)出血的不同原因，做好相應(yīng)的處理和護(hù)理。注意保暖(最好不使用熱水袋)，正確記錄尿量，遵醫(yī)囑準(zhǔn)確及時(shí)靜滴肝素并維持一定血藥濃度。做好各項(xiàng)搶救護(hù)理記錄。術(shù)中嚴(yán)密觀察生命體征變化，保證靜脈通道通暢。

2.1.4 心理護(hù)理:術(shù)中鼓勵(lì)、安慰患者，給予心理支持，使患者主動(dòng)配合治療。

2.2 術(shù)后護(hù)理:

2.2.1 術(shù)后繼續(xù)嚴(yán)密觀察生命體征的變化，做好特護(hù)記錄。

體溫>39 ℃予以降溫，冷敷或?yàn)⒕猎。詼p少耗氧量。同時(shí)，保持尿道通暢，防止管脫落、變壓、扭曲，觀察尿量、顏色及性質(zhì)?；颊哧幍懒餮闆r在切除宮體后逐漸好轉(zhuǎn)。加強(qiáng)基礎(chǔ)護(hù)理，保持病房環(huán)境安靜舒適，積極協(xié)助患者變換，預(yù)防腹部手術(shù)后腸粘連、腸梗阻的發(fā)生。

2.2.2 心理干預(yù):產(chǎn)后失血的強(qiáng)烈刺激，搶救措施的頻繁而緊急，各種搶救儀器的使用，加之醫(yī)務(wù)人員之間嚴(yán)肅的神情，失去子宮所面臨的諸多問(wèn)題，這些突況易使患者惑到自已面臨死亡的威脅，進(jìn)而產(chǎn)生恐懼、緊張、頻躁不安的心理。在護(hù)理中盡量做到有一名護(hù)士始終伴隨左右，及時(shí)告知她有關(guān)信息。并且醫(yī)護(hù)人員保持鎮(zhèn)靜的工作態(tài)度，忙而不亂，注意保護(hù)性醫(yī)療措施以穩(wěn)定患者情緒。待子宮切除的手術(shù)做完，病情穩(wěn)定后，患者往往會(huì)因失去子宮而暗自飲泣，流露出今后的路該怎么走的抑郁趨向。護(hù)士應(yīng)該敏銳地意識(shí)到患者的情緒變化，對(duì)其動(dòng)之以情、曉之以理，讓其比較生命與子宮誰(shuí)更重要。同時(shí)，護(hù)士應(yīng)該做好家屬的心理護(hù)理，要求他們協(xié)助醫(yī)護(hù)人員做好患者的心理支持?；颊呒覍賹?duì)患者體現(xiàn)了無(wú)微不至的關(guān)懷，患者未出現(xiàn)心理問(wèn)題。

3 討論

3.1 產(chǎn)后出血致子宮切除患者的心理特點(diǎn)及干預(yù):由于患者年齡小，對(duì)手術(shù)的方法、安全程度及對(duì)手術(shù)的后果不了解，使其很容易產(chǎn)生恐懼的心理 。同時(shí)，有些患者會(huì)擔(dān)心術(shù)后不能再生育會(huì)導(dǎo)致夫妻感情的破裂。也有部分患者性格偏內(nèi)向，對(duì)醫(yī)學(xué)知識(shí)有所了解，但并不完全準(zhǔn)確，故思想負(fù)擔(dān)過(guò)重。因此，積極的心理干預(yù)就顯得尤為重要。術(shù)前，應(yīng)做好患者的思想工作，解除手術(shù)的種種顧慮，積極給予安慰，消除患者緊張恐懼和不安的情緒。另外，患者家屬的情緒會(huì)直接影響患者的情緒，故不僅要讓家屬克制悲觀情緒，而且要指導(dǎo)他們對(duì)患者進(jìn)行心理安慰，這是能穩(wěn)定患者的心理變化的重要環(huán)節(jié)。術(shù)后要實(shí)行保護(hù)性治療措施，以免患者過(guò)于緊張。對(duì)病情要給予科學(xué)的解釋，做好心理安慰和思想工作。

3.2 產(chǎn)后出血致子宮切除患者的護(hù)理:產(chǎn)后出血的預(yù)后隨失血量、失血速度及產(chǎn)婦體質(zhì)不同而異。嚴(yán)密觀察病情，對(duì)產(chǎn)后出血致子宮切除的患者應(yīng)準(zhǔn)確計(jì)算其失血量，包括沙布、棉墊、手術(shù)單，引流瓶中的血液量等。同時(shí)，將貯血盆墊于產(chǎn)婦臀下以計(jì)算陰道失血量。密切觀察患者生命體征的變化，發(fā)現(xiàn)有心率加快，血壓下降，手足濕冷等休克前期的癥狀及時(shí)通知醫(yī)生，為醫(yī)師的診治提供第一手資料。由于患者存在出血多，創(chuàng)傷大、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、貧血等情況，應(yīng)給予飲食指導(dǎo)，以期患者盡快恢復(fù)體力。囑患者術(shù)后2個(gè)月內(nèi)避免提舉重物，避免從事增加盆腔充血的活動(dòng)。1個(gè)月內(nèi)避免陰道沖洗和性生活，以免影響陰道殘端的愈合，引起感染。遵醫(yī)囑如期返院復(fù)查，若出現(xiàn)陰道出血，異常分泄物更應(yīng)及時(shí)回院檢查。

參考文獻(xiàn)

第6篇

關(guān)鍵詞：心理護(hù)理干預(yù);機(jī)械通氣;氣管插管

神經(jīng)內(nèi)科臨床常見(jiàn)很多病情極其危重的患者，這些患者病情發(fā)展快，危害性大，患者常伴有呼吸無(wú)力，精神萎靡，痰液粘黏不易咳出的臨床表現(xiàn)，臨床常應(yīng)用機(jī)械通氣進(jìn)行緩解患者的臨床癥狀，但是在實(shí)際應(yīng)用中，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間使用機(jī)械通氣的患者常會(huì)出現(xiàn)，舒適感降低，內(nèi)心十分恐慌以及緊張焦慮的表現(xiàn)，在臨床上應(yīng)用心理護(hù)理干預(yù)的方法對(duì)患者的治療有很大的促進(jìn)作用[1]。本文選取我院自2012年1月~2013年6月，進(jìn)行門(mén)診收治入院的患者病例，對(duì)所有患者進(jìn)行心理護(hù)理干預(yù)，并于干預(yù)前后進(jìn)行心理狀態(tài)的對(duì)比分析。

1資料與方法

1.1一般資料選取我院自2012年1月~2013年6月進(jìn)行門(mén)診收治入院的患者病例90例，對(duì)所有患者進(jìn)行心理護(hù)理干預(yù)。其中男47例，女43例，患者的年齡43~79歲，平均年齡是(38.4±11.3)歲，患者的機(jī)械通氣平均時(shí)間是(4.28±6.34)d,患者的性別、年齡和病因上的比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2方法臨床表現(xiàn)呼吸困難，痰多，粘稠的患者給予及時(shí)叩背、吸痰及其面罩吸氧的應(yīng)用。

當(dāng)患者氧分壓80mmhg時(shí)，出現(xiàn)中樞神經(jīng)損傷、外周循環(huán)衰竭在呼吸機(jī)上潮氣量（VT）的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)是8~10ml/kg。呼吸頻率（RR）設(shè)置是12~18次/min，吸入氣氧濃度(FiO2)，常選用30%，對(duì)患者缺氧狀況的改善情況根據(jù)血氧分壓來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)；對(duì)于極危型的患者給予緊急采取氣管切開(kāi)造口通氣，常選擇的位置在第3、4軟骨環(huán)，于頸部進(jìn)行皮切開(kāi)插管，將套管插入氣管，這樣患者能經(jīng)套管進(jìn)行呼吸。

1.3心理護(hù)理干預(yù)方式

1.3.1焦慮感的護(hù)理干預(yù)進(jìn)行機(jī)械通氣的患者其情緒波動(dòng)較大，人工氣道的建立給患者帶來(lái)極大的不適感對(duì)患者的影響很大，此時(shí)患者多存在情緒不安，焦慮、煩躁的思想，需要護(hù)理人與患者進(jìn)行交談，給予患者關(guān)心與愛(ài)護(hù)，尊重和理解患者的心情。

1.3.2自卑感的護(hù)理干預(yù)在進(jìn)行人工通氣的患者，大部分內(nèi)心都會(huì)有著自卑的心理，護(hù)士應(yīng)該對(duì)其心理狀況做出及的了解，讓患者明白機(jī)械通氣對(duì)她們的生活與生命并不會(huì)受到很大的干預(yù)與影響，盡量減輕和消除患者的自卑心理。

1.3.3恐慌感的護(hù)理干預(yù)很多進(jìn)行造口術(shù)通氣的患者，他們都會(huì)存在恐慌的心理，因?yàn)樽陨砗粑δ苁軗p，不能有效的進(jìn)行自主呼吸，身體無(wú)力感和精神萎靡感讓他們有種即將走向死亡的恐懼感覺(jué)。護(hù)理人員應(yīng)該針對(duì)患者在機(jī)械通氣后出現(xiàn)的恐慌感，進(jìn)行有效的評(píng)估，并相對(duì)應(yīng)的進(jìn)行合理的解釋，減輕患者對(duì)身體治療的恐慌[2]。

1.3.4緊張感的護(hù)理干預(yù)進(jìn)行氣管插管的患者，身旁總會(huì)有很多大小型的機(jī)器設(shè)備和導(dǎo)管的鏈接，呼吸機(jī)儀器上面的數(shù)字標(biāo)注和警報(bào)燈的相應(yīng)，同時(shí)還有醫(yī)護(hù)及時(shí)性的來(lái)回訪視和記錄，這不由自主的給患者帶來(lái)一種緊張的氣氛，他們認(rèn)為這種環(huán)境是處于高度集中和壓抑的，導(dǎo)致患者產(chǎn)生高度煩躁、緊張心理。對(duì)于這樣情況下的患者，護(hù)理人員應(yīng)該給與細(xì)心的觀察與呵護(hù)，防止患者因?yàn)榄h(huán)境和氣氛的原因，對(duì)治療情況產(chǎn)生影響。

1.4觀察指標(biāo)在給予患者心理護(hù)理干預(yù)前后進(jìn)行比較，觀察患者的臨床心理狀況，給予患者自行評(píng)估表的形式，進(jìn)行評(píng)估其焦慮感、自卑感、恐慌感、緊張感的表現(xiàn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS18.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以(x±s)表示，以t進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05表示兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

比較分析患者護(hù)理前后的心理狀況，在對(duì)患者進(jìn)行有效的心理干預(yù)后， 給予患者自行評(píng)估表的形式，進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示患者存在的心理狀態(tài)分別是,干預(yù)前:焦慮感33例(36.67%),自卑感21例(23.33%)，恐慌感19例(21.11%),緊張感 17例 (18.89% )；干預(yù)后：焦慮感3例(3.33%)，自卑感4例(4.44%)，恐慌感2例(2.22%)，緊張感2例 (2.22%)，心理護(hù)理干預(yù)后的患者的心理狀態(tài)明顯好于干預(yù)前，前后比較有顯著性差異(P

3討論

由于神內(nèi)科機(jī)械通氣患者的特殊性，有效的心理護(hù)理干預(yù)模式顯得很重要，在操作過(guò)程中需要給予患者悉心的關(guān)照與呵護(hù)，給予患者的相關(guān)疾病的教育，理解和支持患者。給予患者及家屬講解關(guān)于通氣設(shè)置的作用和功能，告誡他們良好的心態(tài)對(duì)疾病的治療與康復(fù)有很好的促進(jìn)作用，讓他們認(rèn)識(shí)到心態(tài)對(duì)疾病預(yù)后的重要性[3]。

護(hù)理人員需要及時(shí)為患者排除心理焦慮與緊張，給予患者更多的心理安慰，與患者平易相處，走進(jìn)他們內(nèi)心，讓他們感覺(jué)醫(yī)護(hù)人員就是他們的知己，同時(shí)告訴患者家屬對(duì)患者要有耐心的態(tài)度與親切的關(guān)心，讓患者感受到家人對(duì)他們的愛(ài)。通過(guò)有效的心理護(hù)理干預(yù)模式，用開(kāi)導(dǎo)和鼓勵(lì)的方式促進(jìn)患者的康復(fù)，讓患者感覺(jué)到溫暖和自信，真正感受到自己的價(jià)值和意義，促進(jìn)疾病的快速康復(fù)。

參考文獻(xiàn):

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第7篇

2003年11月－2005年9月，筆者應(yīng)用柴蒲瀉心湯治療幽門(mén)螺桿菌(HP)相關(guān)性消化性潰瘍 65例，并與含質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑的三聯(lián)療法作對(duì)照，取得良好療效，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 入選病例標(biāo)準(zhǔn)

年齡18～65歲，入選前2 d內(nèi)鏡檢查證實(shí)有胃或十二指腸單一、多發(fā)復(fù)合性潰瘍，潰瘍直徑大于3 mm，潰瘍分期為活動(dòng)期(A期)[1]，HP現(xiàn)癥感染(組織學(xué)、胃活檢尿素酶試驗(yàn))陽(yáng)性。

1.2 排除病例標(biāo)準(zhǔn)

胃鏡證實(shí)非活動(dòng)性潰瘍、活動(dòng)性出血、幽門(mén)梗阻；病理證實(shí)胃潰瘍有可疑及惡變者；經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、B超、X線、CT、心電圖等檢查有心、肺、肝、膽、胰、腎等嚴(yán)重器質(zhì)性疾病者；治療前2個(gè)月應(yīng)用西藥抑酸、抗HP及保護(hù)胃黏膜藥物治療者。

1.3 一般資料

所有病例均為本院住院患者，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的病例共128例，隨機(jī)分為2組。治療組65例，男46例，女19例；年齡20～65歲，平均(41.3±11.5)歲；病程最長(zhǎng)31年，最短6個(gè)月，平均(5.24±2.25)年；胃潰瘍20例，十二指腸潰瘍42例，胃、十二指腸復(fù)合性潰瘍3例。對(duì)照組63例，男44例，女19例；年齡18～65歲，平均(40.5±12.7)歲；病程最長(zhǎng)32年，最短7個(gè)月，平均(4.95±2.14)年；胃潰瘍19例，十二指腸潰瘍41例，胃、十二指腸復(fù)合性潰瘍3例。2組年齡、性別、病程、潰瘍類型、主要癥狀(上腹痛、反酸、腹脹、噯氣、納差、惡心等)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)。

1.4 治療方法

治療組用柴蒲瀉心湯：柴胡10 g，蒲公英30 g，黃芩10 g，黃連9 g，大黃10 g，延胡索10 g，丹參30 g，白及10 g，烏賊骨30 g，白芍10 g，黨參15 g，白術(shù)15 g，茯苓30 g，枳殼10 g，甘草6 g。水煎服，每日1劑，早晚各服1次，連服4周。對(duì)照組用含質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑的三聯(lián)療法：奧美拉唑腸溶片(山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)050203)20 mg，口服，每日1次，連服4周；阿莫西林膠囊(哈藥集團(tuán)三精明水藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)0509219)1.0 g；甲硝唑片(山東博山制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)010003)0.4 g，口服。均每日2次，連服1周。2組均以4周為1個(gè)療程。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

患者于治療前及療程結(jié)束4周后進(jìn)行胃鏡檢查與HP檢測(cè)，并詳細(xì)記錄癥狀、體征變化情況，進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。在治療過(guò)程中，如患者出現(xiàn)腹痛、反酸等癥狀，隨時(shí)復(fù)查胃鏡。表1 胃腸道癥狀評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（略）

1.6 療效標(biāo)準(zhǔn)

1.6.1 臨床癥狀療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

顯效：臨床積分消失，或癥狀積分減少>75%；有效：臨床積分改善，或癥狀積分減少為50%～75%；無(wú)效：臨床癥狀無(wú)好轉(zhuǎn)或加重，或癥狀積分減少

1.6.2 潰瘍療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局1988年制定的療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)定[2]。愈合：潰瘍及周?chē)装Y全部消失；顯效：潰瘍消失，仍有炎癥；有效：潰瘍面積縮小50%以上；無(wú)效：潰瘍面縮小不及50%。

1.6.3 HP根除標(biāo)準(zhǔn)

療程結(jié)束4周后復(fù)查組織學(xué)、快速尿素酶試驗(yàn)，如兩項(xiàng)為陰性，則為根除，如1項(xiàng)或2項(xiàng)為陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，則表示未根除。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)和Ridit分析。

2 結(jié)果

2.1 2組臨床癥狀療效比較

(見(jiàn)表2)表2 2組患者臨床癥狀療效比較[例(略)]注：2組比較，P>0.05。

2.2 2組治療前后主要癥狀積分比較

治療后2組在胃脘痛、返酸的改善方面與治療前比較，差異均有顯著性意義(P

2.3 2組潰瘍愈合情況

(見(jiàn)表4)表4 2組患者潰瘍病灶愈合情況比較[例(略)]注：2組各型潰瘍的愈合率及總有效率比較，P>0.05。

2.4 HP根除情況

治療組65例，HP根除55例(84.6%)；對(duì)照組63例，HP根除52例(82.5%)。2組比較差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.5 不良反應(yīng)

治療組未見(jiàn)任何不良反應(yīng)，對(duì)照組有23例發(fā)生不良反應(yīng)(36.5%)，其中惡心8例，頭暈3例，皮疹3例，便秘3例，口干2例，口中金屬味2例，谷丙轉(zhuǎn)氨酶輕度升高2例。

3 討論

HP是消化性潰瘍發(fā)生的最重要致病因子之一[3]。通過(guò)根治HP促使?jié)冇喜⒎乐箯?fù)發(fā)的嘗試越來(lái)越受到關(guān)注。含質(zhì)子泵抑制劑如奧美拉唑的三聯(lián)療法是目前應(yīng)用較多的根除HP有效方案之一，但由于其治療存在一定的不良反應(yīng)，故治療依從性較差。近年來(lái)由于抗生素的廣泛使用，普遍存在HP耐藥菌株增多的問(wèn)題，如對(duì)甲硝唑耐藥發(fā)生率美國(guó)為24%～70%，韓國(guó)為95%，中國(guó)部分地區(qū)為30%～60%，對(duì)克拉霉素耐藥率約為20%[4]。因此，進(jìn)一步尋找對(duì)HP敏感的藥物已成為臨床迫切的任務(wù)。

消化性潰瘍屬于中醫(yī)“胃脘痛”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，脾胃內(nèi)傷、脾失健運(yùn)是本病發(fā)病的內(nèi)因，外感六、內(nèi)傷七情及飲食勞倦失調(diào)等是發(fā)病的外邪攻擊因素，內(nèi)外因結(jié)合導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失司，升降失調(diào)，氣滯血瘀，濕熱蘊(yùn)結(jié)，氣血不調(diào)，胃膜不生而發(fā)病。臨床上，HP相關(guān)性消化性潰瘍以脾胃濕熱型多見(jiàn)，其次為氣滯血瘀、脾胃虛弱型。柴蒲瀉心湯方中蒲公英甘苦寒，清熱化濕、解毒消癰；黃連、黃芩清熱化濕；延胡索、丹參活血化瘀、通絡(luò)止痛；白及、烏賊骨制酸斂瘍、去腐生肌、護(hù)膜止痛；柴胡、枳殼、白芍、甘草(四逆散)以疏肝理氣、理脾和胃；大黃消滿除脹、下瘀止痛；黨參、白術(shù)、茯苓益氣健脾滲濕，補(bǔ)中焦脾胃之氣，以使“正氣存內(nèi)，邪不可干”。全方共奏清熱化濕、制酸止痛、理氣和血、健脾和胃之效。

現(xiàn)代研究表明，黃連、黃芩、延胡索、丹參、甘草等對(duì)HP有直接殺滅作用[5]；蒲公英對(duì)HP有抑殺作用，并對(duì)損傷的胃黏膜有保護(hù)作用；柴胡能調(diào)節(jié)下丘腦-植物神經(jīng)功能，黨參可提高機(jī)體免疫功能[6]，二藥合用，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)扶正固本而消炎?，F(xiàn)代藥理研究結(jié)果表明，大黃中4種蒽醌化合物除大黃酚有止血作用外，其余均具有抗菌作用，且4種大黃蒽醌化合物皆對(duì)HP有較強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用。最近的研究又發(fā)現(xiàn)原先認(rèn)為無(wú)抗菌作用的某些成分(如大黃酚)對(duì)HP的生長(zhǎng)亦有抑制作用[7]。此外，大黃還對(duì)胃腸黏膜有明顯的保護(hù)作用，并能改善應(yīng)激性胃腸黏膜病變的血流灌注[8]。因此，該方可能通過(guò)抑制胃酸分泌、抑殺HP、改善胃黏膜血流量、增強(qiáng)胃黏膜的屏障功能、促進(jìn)潰瘍愈合來(lái)達(dá)到治療目的。

【參考文獻(xiàn)】

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第8篇

【摘要】 人工構(gòu)建鎘鹽污染源，選用差速離心結(jié)合雙向凝膠電泳（2DPAGE）法，高效提取、分離和篩選牙鲆（Paralichthys olivaceus， PO）受鎘鹽脅迫后的肝臟全蛋白和差異蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 選用直接裂解法提取牙鲆肝（PO liver POL）全蛋白質(zhì)且用2DPAGE分離，可獲得約800個(gè)蛋白斑點(diǎn)，其中鎘鹽誘導(dǎo)了11個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)。以相對(duì)離心力為1000×g、12000×g和100000 ×g 的差速離心法，分別制備了3種沉淀蛋白和1種胞漿蛋白，稱為POL組分Ⅰ、POL組分Ⅱ、POL組分Ⅲ和POL組分Ⅳ（胞漿蛋白），蛋白斑點(diǎn)數(shù)目分別為380、550、500和850個(gè)，總計(jì)2280個(gè)，明顯高于直接裂解法。比較分析法發(fā)現(xiàn)，差速離心結(jié)合2DPAGE分離技術(shù)可獲得牙鲆肝臟受鎘鹽脅迫后表達(dá)的54個(gè)差異蛋白質(zhì)，并適合于用肽質(zhì)量指紋(peptide mass fingerprint，PMF)圖譜技術(shù)鑒定。本實(shí)驗(yàn)所建立的差速離心結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可高效提取、分離和鑒定組織全蛋白或差異蛋白，并能有效地篩選出蛋白指示物。

【關(guān)鍵詞】 牙鲆肝，蛋白質(zhì)組學(xué)，差速離心，鎘污染，蛋白指示物

Abstract Both total proteome and differential proteins were effectively extracted， separated and selected by a combined approach of both differential centrifugation and 2DPAGE in liver of Paralichtys olivaceus( POL) under the stress of cadmium chloride as an artificial pollution source. Approximately 800 spots for extraction of whole protein separated with 2DPAGE were obtained by direct lysis in the POL. In addition， approximately 11 differential proteins in POL were also obtained under the stress of cadmium chloride. The differential centrifugal were used to prepare three sedimentation and a plasmolysis proteins， called POL component Ⅰ， POL component Ⅱ， POL component Ⅲ， and POL component Ⅳ(plasmolysis protein)， respectively. Total protein spots for each gel were calculated to have 380， 550， 500， and 850， respectively， approximately 2280 spots in sum， while total spots are much higher than those by direct lysis approach. Using the comparison method， approximately 54 differential proteins in POL were obtained by a combined technology of both differential and two dimensional polyacylaminde gel electrophoresis(2DPAGE) methods under the stress of cadmium chloride. In addition， these differential proteins can be further identified by peptide mass fingerprint(PMF). Here， these combined techniques can be effectively used to extract， separate and identify the whole proteins and the differential proteins including protein markers in the biological tissue.

Keywords Paralichthys olivaceus liver， proteomics， differential centrifugation， cadmium contamination， protein marker.

1 引 言

建立高效提取與分離動(dòng)植物及微生物組織細(xì)胞中的全蛋白，且可鑒定蛋白質(zhì)的方法，是目前開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究所面臨的技術(shù)難題之一[1，2]。雙向凝膠電泳（2DPAGE）和雙向液相色譜分離（2DLC）技術(shù)是目前開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究的常用分離技術(shù)，但前者易受細(xì)胞組織內(nèi)干擾物影響，例如核酸、多糖和脂類物質(zhì)[3]；而后者在分離過(guò)程中，易丟失部分蛋白質(zhì)，難獲取全蛋白[4]。目前，組織細(xì)胞全蛋白的常用破碎技術(shù)有丙酮沉淀法、裂解法、凍溶法和酶解法等[1～4]。針對(duì)生物材料來(lái)源不同，優(yōu)化提取組織細(xì)胞全蛋白和減少內(nèi)外干擾物是開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)必須克服的難題。至今，相關(guān)的研究已有大量且詳細(xì)的研究報(bào)道[5，6]，但尚未建立一套較為成熟、重復(fù)性高和廣譜性好的細(xì)胞組織全蛋白質(zhì)提取方法。環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)是目前環(huán)境毒理學(xué)中最有挑戰(zhàn)性和前瞻性的領(lǐng)域之一，相關(guān)的研究?jī)H僅處于起步階段。環(huán)境蛋白質(zhì)組學(xué)能同時(shí)篩選與鑒定出由各類重金屬和有機(jī)污染物，在單一和聯(lián)合脅迫效應(yīng)環(huán)境中所誘導(dǎo)的多種蛋白指示物[7，8]，為揭示復(fù)雜的毒理機(jī)理和評(píng)價(jià)危害性提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)[1，2，9]。

本實(shí)驗(yàn)以牙鲆肝臟組織為材料，選用差速離心和雙向凝膠電泳非在線聯(lián)用技術(shù)，高效提取和優(yōu)化分離受鎘鹽脅迫前后的牙鲆肝臟全蛋白，為后續(xù)選用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選及鑒定監(jiān)測(cè)鎘污染程度及危害性的蛋白質(zhì)標(biāo)志物提供可信度較高的結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器、試劑與材料

雙向電泳儀(北京六一儀器廠)；REFLEX 型MALDITOF質(zhì)譜儀（德國(guó)Bruker公司）；各類冷凍離心機(jī)（貝克曼公司）。載體兩性電解質(zhì)（Amersham公司），pH 3～10；胰蛋白酶(Promega公司)；基質(zhì)α氰4羥肉桂酸（美國(guó)ICN生物醫(yī)學(xué)公司）;碘乙酰胺(Sigma 公司)；丙稀酰胺、甲叉丙稀酰胺等試劑均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；勻漿緩沖液：0.25 mol/L 蔗糖，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L TrisHCl，1 mmol/L PMSF (pH=7.4)；樣品裂解液：7 mol/L 尿素，4% CHAPS，2 mol/L 硫脲，60 mmol/L DTT，10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L PMSF，0.5% 載體兩性電解質(zhì)，0.0002% 溴酚蘭。分裝，－20 ℃保存待用；雙向電泳和銀染方法中所需試劑均參考文獻(xiàn)[1，10]。

實(shí)驗(yàn)所需的牙鲆均購(gòu)于廈門(mén)人工養(yǎng)殖場(chǎng)。使用前，牙鲆需在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)一周。實(shí)驗(yàn)前72 h開(kāi)始停止喂食，防止飼料中微量重金屬影響牙鲆的正常代謝。隨機(jī)選擇牙鲆10只，并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組牙鲆置于人工模擬構(gòu)建的CdCl2（10 mg/L）的污染環(huán)境中，繼續(xù)飼養(yǎng)72 h。對(duì)照組牙鲆置于在人工海水中繼續(xù)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前，選用剪斷脊椎處死方式處理牙鲆，并迅速解剖，獲取牙鲆肝臟，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液直接沖洗，并保存在－80 ℃以備使用。

2.2 差速離心提取牙鲆肝臟蛋白質(zhì)

取實(shí)驗(yàn)組（受鎘鹽脅迫）5條牙鲆的肝臟（POL）各20 g，混合后共100 g。對(duì)照組的POL取法同上。加入等體積勻漿緩沖液，在冰浴條件下研磨制成勻漿。隨后，以 400×g 的相對(duì)離心力離心10 min，去除未磨碎的組織和細(xì)胞，收集上清液Ⅰ，備用。選用下列差速離心技術(shù)，分步收集蛋白沉淀物，并選用2DPAGE進(jìn)行有效分離，具體實(shí)驗(yàn)步驟（始終維持在4 ℃環(huán)境下）：（1）1000×g 沉淀分離：以1000×g 的相對(duì)離心力離心上清液Ⅰ10 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅱ。該沉淀物主要是細(xì)胞核，用勻漿緩沖液洗滌兩次，最后收集沉淀樣品備用（－20 ℃保存，下同）；（2）12000×g 沉淀的分離：以12000×g的相對(duì)離心力離心上清液Ⅱ 30 min，收集沉淀蛋白和上清液Ⅲ。選用勻漿緩沖液洗滌該沉淀蛋白兩次，最后收集沉淀樣品備用；（3）100000×g 沉淀的分離: 以100000×g的相對(duì)離心力離心上清液Ⅲ 30 min，收集沉淀蛋白質(zhì)和上清液Ⅳ。上清液Ⅳ中多數(shù)蛋白是胞漿蛋白，收集樣品，凍干備用；(4) 上述所有收集的蛋白組分分別充分溶解于裂解液中，并選用100000×g的相對(duì)離心力離心蛋白樣品 10 min，分別收集上清液，稱為POL蛋白組分Ⅰ（1000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白組分Ⅱ（12000×g 沉淀蛋白）、POL蛋白組分Ⅲ (100000×g 沉淀蛋白)和POL蛋白組分Ⅳ（胞漿蛋白），并用于雙向電泳分離。

2.3 雙向凝膠電泳分離條件

2.3.1 等電聚焦電泳

在上樣之前，參考文獻(xiàn)[10]先進(jìn)行預(yù)電泳。預(yù)電泳結(jié)束后，換上樣品液，在用Bradford法測(cè)定樣品液的總蛋白濃度后，以150 μg 總蛋白上樣，然后進(jìn)行等電聚焦電泳。

2.3.2 凝膠電泳

按照SDS均一膠的配方配置11%膠濃度的凝膠。將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，并在膠條上覆蓋一層含有溴酚蘭的0.5%瓊脂糖，在140 V的恒定電壓下進(jìn)行電泳。待溴酚蘭前沿到達(dá)凝膠底端時(shí)，停止電泳。

2.4 銀染、圖像分析及蛋白鑒定

參照文獻(xiàn)[10]的銀染方法進(jìn)行蛋白質(zhì)染色。染色后，利用掃描儀對(duì)SDS凝膠板進(jìn)行透射掃描。選用Melanie 4 Trial軟件進(jìn)行凝膠電泳圖譜中的蛋白質(zhì)總數(shù)和差異斑點(diǎn)分析與統(tǒng)計(jì)。用REFLEX 型MALDITOF質(zhì)譜儀獲得各蛋白的肽質(zhì)量指紋圖，采用反射模式、正離子譜測(cè)定。激光波長(zhǎng)為337 nm，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加200次，用 BRUKER 肽混合物作外標(biāo)。選用常規(guī)PMF和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)技術(shù)直接鑒定差異蛋白質(zhì)[11] 。數(shù)據(jù)庫(kù)選擇MSDB，檢索基本條件參照文獻(xiàn)[10]。

3 結(jié)果與討論

3.1 直接裂解法POL全蛋白分離

圖1是牙鲆受金屬鎘脅迫后，采取直接裂解法提取POL全蛋白質(zhì)的2DPAGE圖譜。從圖1可看出，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)分布趨勢(shì)基本一致，具有較好的重現(xiàn)性。

采用Melanie 4 Trial軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目統(tǒng)計(jì)與分析，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組2DPAGE圖譜中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目約為800個(gè)，其中多數(shù)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI 范圍集中在 4.5～9.0之間，蛋白質(zhì)亞基的分子量在25～100 kD之間，具有較高的分辨率，適合于后續(xù)蛋白質(zhì)鑒定。

通過(guò)比對(duì)分析，可獲得11個(gè)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，其中高表達(dá)蛋白2個(gè)（A6和A11）；上調(diào)蛋白6個(gè)（A1、A4、A7、A8、A9和A10）；下調(diào)蛋白3個(gè)（A2、A3和A5）。這些差異蛋白斑點(diǎn)均與受鎘鹽誘導(dǎo)有關(guān)，推測(cè)是牙鲆肝臟產(chǎn)生的應(yīng)激蛋白質(zhì)。

3.2 優(yōu)化建立差速離心法分離POL全蛋白質(zhì)技術(shù)

肝臟是動(dòng)物代謝的重要場(chǎng)所之一，具有各類復(fù)雜代謝途徑和含有豐富的蛋白質(zhì)。借鑒文獻(xiàn)［12］，選用2DPAGE分離法可獲得約近千個(gè)鼠肝臟全蛋白斑點(diǎn)數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)選用直接裂解法提取POL全蛋白，但只獲取約800個(gè)蛋白斑點(diǎn)的2DPAGE圖譜。顯然，圖1中的全蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)偏少，不太適合進(jìn)一步深入開(kāi)展POL蛋白質(zhì)組學(xué)研究，尤其不適合研究鎘鹽毒理學(xué)和篩選連續(xù)監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體鎘污染程度的蛋白指示物。在系列比對(duì)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立了差速離心法高效提取牙鲆肝臟全蛋白技術(shù)，具體實(shí)驗(yàn)步驟見(jiàn)圖2。圖2顯示了選用差速離心法使牙鲆肝臟中不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)得到粗分離，減少高豐度蛋白的干擾和提高低豐度蛋白富集的效果，有助于開(kāi)展牙鲆肝臟全蛋白組學(xué)研究和篩選差異蛋白質(zhì)。

目前，常用于動(dòng)物肝臟全蛋白質(zhì)提取技術(shù)且適合于開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法有TCA/丙酮酸沉淀法、緩沖液法、裂解法及“鳥(niǎo)槍”蛋白質(zhì)組分析法[13，14]等。但這些方法獲取肝臟全蛋白種類大都低于1500種，明顯少于本實(shí)驗(yàn)建立的差速離心提取技術(shù)。

3.3 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅰ的差異蛋白

圖3是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅰ全蛋白和差異蛋白圖譜。采用Melanie 4 Trial軟件對(duì)圖解中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，可在亞細(xì)胞組分Ⅰ中獲得約380個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。比較圖3A（實(shí)驗(yàn)組）和圖3B（對(duì)照組），可獲得11個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)。其中A1、A2、A3、A4、A6、A7和A8為上調(diào)蛋白，而A5、A9、A10和A11為下調(diào)蛋白。

3.4 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅱ的差異蛋白

圖4是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅱ全蛋白和差異蛋白的2DPAGE圖譜。經(jīng)統(tǒng)計(jì)與分析后，發(fā)現(xiàn)亞細(xì)胞組分Ⅱ中獲得約550個(gè)蛋白斑點(diǎn)。

比較圖4A（實(shí)驗(yàn)組）和圖4B（對(duì)照組）蛋白斑點(diǎn)分布和差異特性，可獲得13個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)，其中的A1和A4斑點(diǎn)為上調(diào)蛋白；A2、A3、A6、A7、A8、A9、A11和A12斑點(diǎn)為下調(diào)蛋白；A5、A10和A13為高表達(dá)蛋白（high expression proteins）。

3.5 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅲ的差異蛋白

圖5是在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅲ的全蛋白和差異蛋白質(zhì)的2DPAGE圖譜。經(jīng)分析與統(tǒng)計(jì)，可獲悉圖5顯示出約500個(gè)蛋白斑點(diǎn)。比對(duì)圖5A和圖5B結(jié)果，可進(jìn)一步獲悉兩圖之間約有14個(gè)差異蛋白斑點(diǎn)。其中的A10、A11和A14斑點(diǎn)為上調(diào)蛋白；A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A12和A13斑點(diǎn)為下調(diào)蛋白。

3.6 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白

通常認(rèn)為，細(xì)胞破碎液經(jīng)100000×g的相對(duì)離心力離心后所獲得的蛋白上清液視為細(xì)胞的胞漿蛋白。根據(jù) 3.2 節(jié)所描述的實(shí)驗(yàn)步驟和離心率可獲悉，牙鲆肝臟組分Ⅳ屬于胞漿蛋白質(zhì)。在鎘鹽脅迫下，所獲得牙鲆肝臟組分Ⅳ的差異蛋白質(zhì)，視為金屬鎘脅迫牙鲆肝臟表達(dá)的差異胞漿蛋白。從圖6中可看出牙鲆肝臟組分Ⅳ含有約850個(gè)蛋白斑點(diǎn)，其胞漿蛋白質(zhì)種類明顯高于其它牙鲆肝臟組分的蛋白質(zhì)種類，說(shuō)明了牙鲆肝臟含有豐富的胞漿蛋白質(zhì)。比較圖6A和圖6B中的差異蛋白斑點(diǎn)分布情況和規(guī)律可獲悉， 在鎘鹽脅迫下，牙鲆肝臟表達(dá)了16種差異蛋白，其差異蛋白總數(shù)目多于其它POL組分。其中高表達(dá)的蛋白質(zhì)為A1、A2、A4和A9；上調(diào)蛋白為A5、A6、A7、A10、A11和A14；下調(diào)蛋白為A3、A8、A12、A13、A15和A16。

進(jìn)一步選用肽質(zhì)量指紋（PMF）圖譜和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)技術(shù)對(duì)上述54個(gè)差異蛋白進(jìn)行鑒定.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有3種同類差異蛋白，即共有51個(gè)不同的差異蛋白。在鑒定結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了一些文獻(xiàn)[15，16]中已報(bào)道的與鎘鹽脅迫有關(guān)的蛋白（見(jiàn)表1）。表1 牙鲆肝臟中表達(dá)的與鎘鹽脅迫有關(guān)的差異蛋白的質(zhì)譜鑒定（略）

總結(jié)圖3～6中所顯示的蛋白斑點(diǎn)數(shù)目可獲悉，選用差速離心法分離牙鲆肝臟的全蛋白種類約2280個(gè)，明顯高于直接裂解法（800個(gè)蛋白斑點(diǎn)）的結(jié)果。雖然選用不同離心力分離POL亞細(xì)胞蛋白組分之間含有同一類蛋白，但只發(fā)現(xiàn)存在少量同類蛋白質(zhì)，說(shuō)明了選用差速離心法所獲取的POL全蛋白中只含有少量的同類蛋白質(zhì)，推測(cè)所獲得的蛋白種類應(yīng)高于2000種，適合于開(kāi)展POL蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在鎘鹽脅迫下，同樣也獲取54種差異蛋白，其中只有3種同類差異蛋白，即鎘鹽脅迫牙鲆肝臟表達(dá)了51種差異蛋白，這也適合于篩選潛在的可用于研究金屬鎘毒理學(xué)和監(jiān)測(cè)流動(dòng)水體重金屬污染的蛋白質(zhì)指示物。顯然，差速離心結(jié)合雙向電泳技術(shù)顯著提高了牙鲆肝全蛋白的分離效率和差異蛋白的檢出率。

由于動(dòng)物組織、細(xì)胞及卵等中蛋白質(zhì)種類間存在豐度差異[17]，現(xiàn)有的全蛋白提取與分離技術(shù)不易通過(guò)單一的2DPAGE方法同時(shí)顯示高低豐度不同的蛋白質(zhì)。而本實(shí)驗(yàn)所建立的差速離心技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，不僅降低蛋白之間產(chǎn)生沉淀現(xiàn)象，而且還使許多低豐度蛋白得以富集和鑒定，從中獲取更多的蛋白種類。在蛋白的分離效率上明顯高于現(xiàn)有的全蛋白提取與分離技術(shù)，如直接裂解法，適合開(kāi)展蛋白質(zhì)組學(xué)研究和篩選與鑒定差異蛋白質(zhì)組學(xué)。前人研究已發(fā)現(xiàn)，熱激蛋白質(zhì)70S（HSP70）和過(guò)氧化氫酶均可作為監(jiān)測(cè)金屬鎘污染或氧化損傷的指示蛋白[15，16]。從表1所鑒定的差異蛋白質(zhì)種類中也含有這兩種蛋白。此外， V型ATP酶和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白（例如：Bete 微管蛋白和actin）等均與鎘代謝和受鎘抑制表達(dá)有關(guān)。這說(shuō)明，選用蛋白質(zhì)組學(xué)及相關(guān)分析技術(shù)可篩選并鑒定許多潛在的適合作為蛋白質(zhì)指示物且可用于開(kāi)展鎘毒理學(xué)機(jī)理、污染程度的關(guān)鍵指示蛋白質(zhì)[18～20]。

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