發(fā)布時間：2024-03-06 14:44:43
序言：寫作是分享個人見解和探索未知領域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的發(fā)育生物學的研究進展樣本，期待這些樣本能夠為您提供豐富的參考和啟發(fā)，請盡情閱讀。
【關鍵詞】性別控制，畜牧業(yè)，性別決定，發(fā)展前景
性別控制一直是生命科學的重要研究課題之一，性別控制技術是指通過對動物的正常生殖過程進行人為干預，使成年雌性動物產(chǎn)出人們期望性別后代的一門現(xiàn)代生物技術，是一項能顯著提高家畜繁殖效率的生物工程技術，對家畜育種，生產(chǎn)和遺傳疾病的繁殖都有很重要的意義。在畜牧業(yè)生產(chǎn)中許多性狀受到性別因素的制約，性別控制技術對于我國現(xiàn)有生產(chǎn)條件不變而奶制品和肉制品需求迅速增加的現(xiàn)狀來說，更意味著生產(chǎn)資料的高效利用和畜牧業(yè)生產(chǎn)效率的提高。
1性別決定原理
哺乳動物性別分化之前，僅有位于中腎內緣的性腺原基，這種未分化的性腺中胚層處于中性。胚胎是含有牟勒氏管、吳夫氏管兩套生殖導管和未分化性腺的中性胚，性腺原基分化的類型決定了機體將來性別的發(fā)育（張紅衛(wèi)等，2001）。當性腺原基被決定因子（SRY）誘導發(fā)育成，支持細胞則會分泌抗牟勒氏管因子而使牟勒氏管解體，這時吳夫氏管發(fā)育為雄性生殖管道。當性腺原基發(fā)育為卵巢，由卵巢分泌的雌激素則使牟勒氏管發(fā)育為陰道、子宮和輸卵管等（朱必才等，2002）。目前發(fā)現(xiàn)， 性別決定過程中有三種基因調控未分化性腺的發(fā)育及雄性性別決定，分別是WT-1、SF-1和SOX9。
2性別控制方法
目前研究性別控制的途徑和方法主要集中在受精前X、Y的分離，受精后的胚胎性別鑒定和控制。
2.1 X與Y的分離
精母細胞經(jīng)過有絲分裂后產(chǎn)生X、Y兩種不同類型的，如果X和卵子結合則產(chǎn)生雌性后代，若Y和卵子結合則產(chǎn)生雄性后代。分離動物中X和Y， 是解決家畜性別控制的關鍵問題。
X和Y的差異主要表現(xiàn)在：形態(tài)上，X 頭部比較大， DNA含量多；在重量和比重上，X重，比重大且表面膜電荷多；在運動性和活力方面，Y活動能力較強， 速度快；耐酸堿性方面，Y 嗜堿不耐酸；并且YF一小體陽性（朱曉華等，2001）。
目前分離X和Y的方法主要有：沉積分離法、梯度離心法、電泳法、白蛋白沉淀法、免疫法、流式細胞儀分類法。
沉積分離法主要是利用X沉積速率比Y快的原理來分離，但是這種方法由于缺乏重復性和其它動物實驗的證實而為廣泛采用（張光勤和李建民，2002）。梯度離心法是根據(jù)X染色體的體積比Y染色體的大，且比重不同等特點來分離的，但是該方法只能做到大部分分離，因此性別控制也只能達到70～80%（巖崎說雄等，1987；張光勤和李建民，2002）。電泳法主要是根據(jù)X、Y所帶的生物電不同而設計的一種分離方法，以中型緩沖液電泳時向陽離子移動的X比Y多來對進行分離，但是分離結果的準確性和重復性都不理想，并且在電泳液中不易存活，分選后的活力低，因此難以推廣（張淑娟，2005；George et al.， 2002）。
白蛋白沉淀法是依據(jù)Y在白蛋白溶液中的運動速度比X的快的原理來分離的，但是這種方法對于性別比例的改變并不是十分明顯，因此存在爭議（White et al.， 1984；石磊和岳文斌，2007）。免疫法是根據(jù)H-Y抗原特異表達于Y細胞膜上，利用H-Y抗體來檢測抗原，但是有研究表明X也能結合抗H-Y抗原抗體，因此，在本質上X、Y會共享抗原（Zavos，1983；Hendriksen，1999）。
目前比較理想的方法是流式細胞儀分類法，它是根據(jù)X、YDNA含量的微小差異來分離的，是當前分離純度最高的一種方法，一般分離率可達70～90%，而且分離后的仍具有發(fā)育能力，其主要缺點是分離速度慢、時間較長、成本高難以商業(yè)化（馮伯森等，2000；George et al.， 2002； 張明和盧克煥，2003；陸陽清等，2005）。
2.2胚胎性別鑒定
胚胎性別鑒定的主要方法有核型分析法，X-相關酶法，免疫學方法，分子生物學方法等。核型分析法通過查明胚胎細胞的性染色體類型為XX型和XY型來鑒定胚胎的性別，該方法準確率高，幾乎可達到100%，但操作繁瑣，對胚胎有一定的傷害，不適合生產(chǎn)實際，目前主要用來驗證其它性別鑒定方法的準確率（葛寶生等，1998；華進聯(lián)等，1999）。X-相關酶法是通過測定與X染色體相關的酶活性來鑒定雌性胚胎的一種方法，其依據(jù)是：在胚胎發(fā)育早期，雌性的一條X染色體失活；在胚胎基因組的激活和X一染色體失活之間的短暫時期內，雌性的兩條X一染色體都可以被轉錄和翻譯，這表明在雌性胚胎中與X一染色體相連的酶細胞內活性是雄性的兩倍，但這種方法中測定次黃漂吟磷酸核糖轉移酶對致密桑套胚或囊胚階段的胚胎應用有困難，難以確定X染色體失活的準確時間，并且還具有潛在的細胞毒性（魏雅萍，2003；張傳生和杜立新，2001；馮伯森等，2000）。
免疫學方法是利用H-Y抗血清或H-Y單克隆抗體檢測胚胎上是否存在雄性特異性H-Y抗原，從而鑒定胚胎性別的一種方法，它包括間接免疫熒光法和細胞毒性分析法（Hossepian，1993）。間接免疫熒光法先將胚胎在H-Y抗血清或單克隆抗體中培養(yǎng)，再用異硫氰酸鹽熒光標記的免疫球蛋白IgM處理， 然后在熒光顯微鏡下檢查胚胎是否帶有熒光素， 若有則判定為H一Y+胚胎， 不顯熒光則為H一Y-胚胎。這種方法雖然不損害胚胎，準確率高，但是具有一定的主觀性（馮伯森等，2000）。細胞毒性分析的原理是在補體存在的情況下，H一Y抗體可以和H-Y陽性雄性胚胎結合并使卵裂球溶解，而仍能正常發(fā)育的為雌性胚胎。但是這種方法對細胞殺傷作用，已很少采用（馮伯森等，2000；張光勤和李建民，2002）。分子生物學方法是近十幾年發(fā)展起來的一種利用雄性特異性SRY基因和PCR擴增技術鑒定性別的一種方法。擴增后經(jīng)電泳檢測，能擴增出序列的為雄性，反之為雌性。這種方法靈敏度高， 準確率高，是目前為止最為理想的胚胎性別鑒定方法之一（魏雅萍，2003）。
3性別控制的意義
性別控制具有重大的意義，其一，可以大大提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟效益。畜牧業(yè)生產(chǎn)中不同性別的家畜有不同的用途，因此可運用此技術提高大量雌性個，如奶牛、母雞的數(shù)量，而且可以節(jié)約雄性個體在繁殖年度的飼料消耗。相，雄性肉牛，綿羊和豬等增重要快，肉質優(yōu)良等特點也可通過此技術控制多產(chǎn)雄比后代。并且可以有效的防止牛的異性孿生不育癥。其二，可以排除動物群體中的有害基因，預測和控制家畜的遺傳和表型性別，增加選育強度，獲得最大的遺傳進展。其三，控制性別與胚胎移植，胚胎冷凍等技術的應用，可加速瀕危動物，珍稀動物的繁殖和保種進程。.性別控制也是體外受精，核移植單精注射及轉基因動物的一項配套技術，它的應用必將促進其它生物技術的發(fā)展。
我國是個發(fā)展中國家，奶、肉人均消費長期曾低于世界平均水平，近年來經(jīng)濟飛速發(fā)展，我國對奶、肉的需求量巨增，通過性別控制技術來快速繁殖性別控制后代，能更好地滿足社會快速的需求增長（文國藝，2004）。
4問題及其發(fā)展前景
性別主要是由遺傳決定的，目前家畜的性別控制技術已在商業(yè)上應用，并且已成為畜牧業(yè)發(fā)展中的主要技術之一。盡管應用流式細胞儀分離已取得了很大進展，但是性別控制技術在生產(chǎn)中的普及還存在許多限制性的因素，如成本高，耗時長，技術要求高等。我們可以通過添加飼料營養(yǎng)或堿性飼料、添加微量元素、按摩、提高冷凍的解凍溫度等措施來提高產(chǎn)雌率（齊義信和李愛蕓，2001；趙峰，2002；白海湖，1997；姜忠玲，2004）。
畜牧業(yè)的發(fā)展促進了家畜性別控制的研究，目前動物的性別控制技術已取得了一定成果，但距離對生物性別進行有效控制或使用胚胎性別鑒定達到實用化水平還有一定差距。運用流式細胞分離法和SRY基因PCR擴增法是準確而發(fā)展前景比較廣闊的性別控制方法，但是分離速度較慢，因此，需要提高速度以便在生產(chǎn)中廣泛應用，同時加強與體外受精和顯微受精技術的結合，從而提高的利用率。運用SRY基因PCR技術鑒定胚胎性別關鍵在于提高靈敏度減少細胞取樣對胚胎的損傷，取樣胚胎冷凍后移植妊娠率等。另外， 需要研究家畜SRY基因PCR擴增試劑盒，使這種方法的操作簡單而實用，同時廣泛的進行研究運用胚胎工程等學科的前沿技術來提高性別控制的準確率，將在畜牧業(yè)上得到廣泛的應用?？梢韵嘈?，隨著研究的深入和相關生物技術的發(fā)展，效果耿介穩(wěn)定的性別控制技術是可以實現(xiàn)的，并且哺乳動物的性別控制技術與胚胎移植技術、體外受精技術、胚胎冷凍技術相結合將會共同推動畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)化的前進。
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【關鍵詞】進化生物學 課程 教學改革
【中圖分類號】G642.0 【文獻標識碼】A 【文章編號】1674-4810（2014）14-0025-02
進化生物學是在生物進化論的基礎上發(fā)展起來的一門學科。20世紀后期，隨著遺傳學、生物化學，尤其是分子生物學的發(fā)展，推動生物進化論從推理到驗證，從定性到定量，使得這門學科由模糊的理論推測日漸發(fā)展為脈絡清晰的系統(tǒng)學科。它從各門功能生物學科獲得研究基礎，綜合形成的一般規(guī)律和理論又成為整個生命科學的發(fā)展線索。邁爾曾說：“進化生物學是生命科學中的最大的統(tǒng)一理論”，是建立在生命科學各層次研究和各分支學科基礎之上的理論綜合。由于進化生物學涉及學科廣泛，是高度概括的綜合性理論，實踐環(huán)節(jié)存在困難等原因，導致進化生物學教學有其獨特性，本文從教學實踐經(jīng)驗出發(fā)，就進化生物學課程改革方面進行探索。
一 課程目標的設置
針對進化生物學既是生命學科各分支學科的綜合，也是生命科學領域的一門前沿學科，又是生命科學的一個核心理論的課程特點，在課程目標的設置上力求做到以下三點：
1.牢固掌握本課程基礎知識和理論
主要包括生命及其在地球上的起源、細胞的起源與進化、生物發(fā)展歷程、微觀進化、宏觀進化、遺傳系統(tǒng)的進化及人類起源等問題，這些知識既是進化生物學教學的主要內容，也是學生學習的重點所在。這些內容涵蓋了各門生物學分支學科的成就，特別是把植物學、動物學、細胞學、遺傳學、生態(tài)學和分子生物學等結合起來研究有關生命進化的問題，力求讓學生在掌握生命進化的基本歷程、進化的動力機制，學會對進化現(xiàn)象進行正確的理論分析的基礎上，培養(yǎng)對生命科學各分支學科融會貫通的能力。
2.密切結合生命科學研究中各學科的最新研究進展
進化生物學是生命科學中一個相當活躍的領域，新知識、新理論層出不窮。本課程以現(xiàn)代達爾文綜合進化論為基礎，同時密切結合生命科學研究中的最新進展，把各個學科前沿進展融入教學過程中，如以鳥類手指同源問題講解物種特化式進化中的分歧進化，在“適應”的問題上聯(lián)系燕子為躲避車輛進化出更短的翅膀等，把一些最新進展融入理論教學中，不僅增強學生對理論知識的理解與學習興趣，更能開拓學生的知識層面，也體現(xiàn)了進化生物學是一門前沿學科的地位，吸引學生從事進化生物學的研究。
3.著重培養(yǎng)學生對自然界進化過程的正確認識和理解
進化生物學是在哲學思想指引下產(chǎn)生的，研究進化的過程本身就是將古論今，“現(xiàn)在就是過去的鑰匙”，通過學習能夠加深對生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的正確理解，單獨的思想教育往往說服力不足，課程中引入大量的數(shù)據(jù)和事實，培養(yǎng)學生對問題的分析能力，如讓學生從微觀進化角度對生物多樣性進行分析，探討生物大滅絕對生物環(huán)境保護的意義，從人類進化歷程角度談如何摒棄“為人獨尊”的思想等，把這種思想的教育貫穿始終，幫助學生樹立科學的世界觀，這也是對辯證唯物主義自然觀最好的驗證。
二 優(yōu)化課程內容體系
進化生物學研究內容貫穿生命科學的各個分支學科，甚至其他自然科學和社會科學門類中都會觸及生命起源及進化的問題。在國外很多大學都把進化生物學列為生物學專業(yè)基礎課、研究生基礎課，甚至成為一門通識課。耶魯大學開放課程進化、生態(tài)和行為原理從2009年錄制以來風靡全球。
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* 基金項目：大慶師范學院教育教學改革項目（編號：JY1320）
在我國，很多高師院校把進化生物學課程設置為生物科學專業(yè)必修課，一般在學習最后階段開設；也作為生物學其他專業(yè)，如生物技術、生物工程的選修課，也有院校將生命起源與進化之謎作為一門通識課來開設。由于進化生物學融匯眾多交叉學科，每個學校學科課程設置各有不同，教材內容不可能完全適應具體情況，不同學校不同專業(yè)的課程內容不能一味照搬。我院曾把進化生物學作為生物科學專業(yè)必修課，生物技術專業(yè)選修課和全校學生的通識課開設，在圍繞基礎知識和原理的基礎上，對課程內容進行了如下優(yōu)化：
1.對于生物科學專業(yè)師范生而言，進化生物學課程在初中、高中課本都有體現(xiàn)，應該詳盡系統(tǒng)地開設
通過對生物進化的歷史過程、原因、機制、速率、趨向和物種的形成與絕滅、系統(tǒng)發(fā)生以及適應的起源機制等內容的學習，使學生掌握生物進化理論中的基本概念，認識生命進化的基本歷程、進化的動力機制，學會對進化現(xiàn)象進行正確的理論分析，融會貫通各分支學科；同時激發(fā)學生對生命科學的學習興趣，樹立科學的世界觀，培養(yǎng)具有用進化理論來綜合生物學各個學科知識的能力的高素質人才。
2.對于生物技術專業(yè)的學生而言，應該有針對性地進行開設
由于生物技術專業(yè)的學生有一定的生物學基礎，進化生物學課程主要應從生命史、小進化（種內水平的進化）、大進化（種以上水平的進化）及人類的起源與演化四個主要方面講解，著重從個體、群體以及物種等不同分類群探討進化的規(guī)律，涉及學生已掌握的細胞生物學、分子生物學和發(fā)育生物學等學科領域，加深對各個學科知識的貫通，著重對學生進行生物進化思想的培養(yǎng)，讓學生對生物進化的本質有一個科學的認識，培養(yǎng)適應新時期社會高速發(fā)展的科技人才。
3.作為一門通識課，針對生物基礎知識相對薄弱的學生開設，課程學時一般為18學時
課程從宏觀角度對生物的發(fā)展歷程、人類的起源與進化等問題入手展開，介紹地球的形成與演化、環(huán)境系統(tǒng)的演變、生命的起源、生物與環(huán)境的協(xié)同關系等，展示人類探索生命起源、探索天外生命的科學成果和艱辛歷程。審視30億年來主要生物類群的延續(xù)發(fā)展，探索起源、分化和滅絕等問題，使學生樹立生物與環(huán)境相互聯(lián)系、生物具有適應性和多樣性的觀點，在教學過程中加強辯證唯物主義的世界觀教育，使學生正確地認識人類在自然界中的地位，人與自然協(xié)調發(fā)展的必要性，培養(yǎng)大學生探索科學的興趣，增強其珍惜生命和保護環(huán)境的意識。
三 課堂教學改革
進化生物學課堂教學既要符合課堂教學的一般教學規(guī)律，又要充分體現(xiàn)課程的獨特性。在教學過程設計上將學術性與趣味性有機結合，緊密聯(lián)系生活實際，并采用靈活多變的教法，豐富的多媒體資源，讓學生展開討論和辯論等形式激發(fā)學生學習興趣，進一步提高課堂教學質量。
1.課堂教學形式的改革，以學生活動為主體，師生角色互換
進化生物學是一門前沿的學科，有很多未知的內容等待我們去探索，對于一些前沿的問題，如恐龍滅絕之謎，地球之外是否有生命，下一次物種大滅絕的預測等問題，讓學生自行組織，用多媒體報告的形式做介紹，各小組相互提問，并按照評價表進行打分，小組成績就是小組成員的成績，以此培養(yǎng)團隊精神，讓學生真正融入其中，真正落實“以學生為主體”的教育理念。
2.靈活運用現(xiàn)代教學手段，提高教學質量和效率
對現(xiàn)代教學手段的大規(guī)模應用還存在褒貶不一的看法，但對于進化生物學課程而言，選擇有代表性的圖片、音像資料能吸引學生注意力，豐富課堂內容。如古生物的化石，冥古代地球表面特征等，學生理解起來有一定的難度，但用一張想象圖卻能集中學生注意力，降低學習難度。另外，借鑒并剪輯國內外大型探索片、紀錄片、科幻片中相關內容及其中涉及的電影片段，如《宇宙的誕生》《與遠古人同行》等，這些音像資料有效地提高和調動了學生的學習興趣，也為進一步探討一些科學問題提供了證據(jù)和平臺。多媒體課件具有信息豐富、形象、通俗易懂等特點，學生易于接受，便于他們掌握重點內容。
3.教學過程與觀察、實驗相結合，注重實踐教學環(huán)節(jié)
作為一門理論學科，必須要有實踐環(huán)節(jié)的支持，而生物進化的歷程有數(shù)十億年之久，無法真實再現(xiàn)當時的情境，這成了進化生物學實踐環(huán)節(jié)的難題。課堂教學主要從基礎課程植物學、動物學實踐教學展開，通過對以往知識的回顧、實踐結果的描述和多媒體圖片視頻展示，讓學生對生物進化歷程有一個初步的認識。對于有些歷史階段沒有化石等直接證據(jù)，則利用解剖學、胚胎學和發(fā)育生物學等知識內容，從現(xiàn)存的狀況去推斷過去的事件，如利用系統(tǒng)生物學方法通過對現(xiàn)生類群的研究，推斷生物的系統(tǒng)發(fā)育。還可以帶領學生參觀博物館、地質館，通過研究已滅絕的生物骨骼化石標本和對不同地質斷層進行分析比較的活動，讓學生獲取最直觀的認識，總的來看，效果還不錯。
四 展望
進化生物學從探索生命起源出發(fā)，融會眾多學科內容，以哲學思想概括總結出理論知識，通過認識生命來源和歷程，從而加深理解生命和尊重生命，以進化的思想升華生態(tài)環(huán)境保護的意識，樹立人類發(fā)展必須自覺地順從并維護生物與環(huán)境的協(xié)同演化的觀點，對于培養(yǎng)大學生系統(tǒng)地認識自然界具有重要意義。建議除了在生物相關專業(yè)開設必修課和選修課外，還應該在醫(yī)學院校、師范院校和綜合性院校廣泛開設公共通識課，特別是在將來從事科普工作、小學幼兒教育、心理學等相關行業(yè)工作的學生中開設通識課，以此培養(yǎng)學生樹立人與環(huán)境和諧可持續(xù)發(fā)展的觀念，建立正確的世界觀、人生觀、價值觀。
參考文獻
【關鍵詞】干細胞；腫瘤干細胞；神經(jīng)干細胞
干細胞是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下它可以分化成多種功能細胞。干細胞的用途非常廣泛，涉及到醫(yī)學的多個領域。目前科學家已經(jīng)能夠在體外鑒別、分離、純化、擴增和培養(yǎng)人體胚胎干細胞，并以這樣的干細胞為“種子”，培育出一些人的組織器官。干細胞及其衍生組織器官的廣泛臨床應用，將產(chǎn)生一種全新的醫(yī)療技術，也就是再造人體正常的甚至年輕的組織器官，從而使人能夠用上自己的或他人的干細胞或由干細胞所衍生出的新的組織器官，來替換自身病變的或衰老的組織器官。本文將對腫瘤干細胞、心肌干細胞以及神經(jīng)干細胞的研究做如下綜述。
1、腫瘤干細胞概述
1.1腫瘤干細胞學說的提出。1960年以來，許多動物實驗證明只有當腫瘤細胞數(shù)大于100萬時才可以形成新的腫瘤。一些研究顯示并不是所有的腫瘤細胞都能增殖，可能只有小部分腫瘤細胞具有滯留源性，而大部分是腫瘤起始細胞或腫瘤干細胞。隨著對干細胞研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)干細胞和腫瘤干細胞之間具有許多共同特征：他們都具有多向分化潛能和自我更新能力，以及相似的細胞表面標志和相同的信號調節(jié)通路等[1]。于是提出腫瘤起源于腫瘤干細胞，是一種干細胞疾病，腫瘤是正常干細胞累計突變的結果，“腫瘤干細胞學說”應運而生。
1.2腫瘤干細胞的分離和鑒定。近年來，干細胞研究的發(fā)展很大程度上依賴于細胞分化抗原的研究進展，細胞表面特異性標志的確定是腫瘤干細胞分離的第一步。一般原則為結合譜系標志，正常干細胞特異標志（如BTSC的CD133與分離LSC的CD34）以及正常組織特異性標志等綜合評價[2]，很多學者認為結合陽性標志和陰性標志可以更有效地分離干細胞。目前高通量的細胞分選系統(tǒng)主要有：磁性細胞分選系統(tǒng)和流式細胞技術（FACS）[3]。
1.3腫瘤干細胞研究方向。①研究論證是否每一種腫瘤細胞，不論是良惡性都存在腫瘤干細胞。②確定細胞表面標志，爭取使用特異性強的藥物殺滅腫瘤干細胞。③對已分離鑒定的腫瘤干細胞，從其特性入手，即誘導其分化，使其喪失自我更新的能力。④研究表明，Notch、wnt、Shh、Bmil等細胞信號轉到通路調節(jié)正常干細胞的自我更新、增生、分化，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。通過研究這些細胞信號通路，有助于我們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞干細胞的靶位用于抗癌治療。⑤發(fā)展高效的體外培養(yǎng)系統(tǒng)、細胞擴增技術以及維持干細胞未分化狀態(tài)技術是今后研究的重任。目前實體瘤中的乳腺癌干細胞和淋巴造血系統(tǒng)惡性腫瘤干細胞已被發(fā)現(xiàn)并分離，但隨后需進一步證實更多實體瘤腫瘤干細胞的存在，并從腫瘤中分離純化腫瘤干細胞，在此基礎上確定腫瘤干細胞的基因圖譜，尋找腫瘤干細胞表現(xiàn)出來的特異靶位，研制新的針對于腫瘤干細胞的藥物，以達到腫瘤的根治療效。
2、心肌干細胞概述
2.1心肌干細胞簡介。2003年，Beltrami等首次從大鼠心肌內分離出一種具有自我更新能力的細胞，并具有分化成心肌細胞，內皮細胞以及平滑肌細胞的能力。將這些細胞移植到心肌梗死大鼠心肌內，可分化成新的心肌細胞并明顯改善心臟功能。這類細胞認為是心肌干細胞。Laflamme等的實驗也證實成人心臟中有心肌干細胞的存在，它能夠再生心肌，并且損傷時這種修復功能會增加[4]。Laugwitz等則證實心臟間質中存在著能完全分化成心肌表型的祖細胞。這些不同研究結果均表明了人類的成年心肌內都存在具有多向分化潛能的心肌干細胞。
2.2心肌干細胞分化起源。胚胎干細胞時全能干細胞能分化幾乎全部組織和器官。1981年，鼠的胚胎干細胞首次分離成功。1998年Thomson首次從人囊胚中分離出人類胚胎干細胞。研究發(fā)現(xiàn)人類胚胎干細胞可以體外分化為心肌細胞。骨髓間充質干細胞也可以分化成心肌干細胞，研究發(fā)現(xiàn)骨髓源性祖細胞能夠想造血細胞，血管和心肌等直接分化[5]。
2.3心肌細胞的定向分化及其調控。心肌干細胞向心肌分化受到多種因素的誘導和調控，目前已知細胞因子，激素，藥物以及細胞內轉錄因子等都可以參與心急干細胞的分化調控。例如催產(chǎn)素可以與心肌干細胞表面受體結合，促進干細胞的有絲分裂；骨形態(tài)發(fā)生蛋白是一類在胚胎發(fā)育過程中起重要作用的蛋白家庭，它們可以參與調節(jié)某些心臟轉錄因子的表達，對心肌干細胞的定向分化起重要作用。
3、神經(jīng)干細胞概述
3.1神經(jīng)干細胞來源。①來源于腦組織，包括胚胎腦組織和成人腦組織；②來源于精髓。在胚胎和成人的脊髓室管內都存在神經(jīng)肝細胞；③來源于骨髓。骨髓中存在骨髓基質肝細胞，在特定的條件下可以跨系統(tǒng)分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞；④臍血。人臍血是胎兒出生時期胎盤近胎兒一側血管內的血液，含有豐富的肝細胞；⑤其他來源。近年來有學者發(fā)現(xiàn)，臍帶華兒通膠來源的基質細胞有與骨髓間充質細胞相似的特性[6]。
3.2神經(jīng)干細胞的分化。目前絕大多數(shù)的研究者認為，神經(jīng)干細胞的分化存在細胞自身基因調控和外源性信號調控兩種基質。這兩種調控方式不斷相互作用，共同完成對肝細胞分化的控制?，F(xiàn)在神經(jīng)干細胞分化研究還沒有形成一個完全可靠的系統(tǒng)，僅僅只是就某一個途徑或細胞因子等的研究。這主要是由于體內有上百種類型的神經(jīng)元，每一種神經(jīng)元的分化過程均涉及多種影響因素和信號傳遞。誘導神經(jīng)干細胞高效分化成目的神經(jīng)元或特定類型的神經(jīng)膠質細胞仍處于探索階段。
3.3神經(jīng)干細胞研究前景。神經(jīng)干細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在被證明，以及分離培養(yǎng)的成功是神經(jīng)科學研究的一個重要突破。目前神經(jīng)干細胞的研究公正如火如荼地進行，對神經(jīng)干細胞的基礎研究取得顯著成果，但是將其常規(guī)應用于臨床仍有許多問題需要解決，以及如何從動物的應用順利的過度到臨床的應用還需要進行深入的研究。
4、結語與展望
干細胞是動物機體內的一種發(fā)育全能性細胞。目前對干細胞的研究取得的進展都是在闡明干細胞的生物學特性，以及對干細胞的選擇性分化和生長，然而如何對干細胞的生物學特性進行很好的控制還沒弄清楚，這需要人們進一步研究和探索。隨著基因工程、胚胎工程、細胞工程等各種生物技術的快速發(fā)展，按照一定的目的，在體外人工分離、培養(yǎng)干細胞已成為可能，利用干細胞構建各種細胞、組織、器官作為移植器官的來源，這將成為干細胞應用的主要方向。
【參考文獻】
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【關鍵詞】兒童早期綜合發(fā)展；嬰兒；智能發(fā)育
【中圖分類號】R 179 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004―7484（2013）09―0642―02
1 對象和方法
1.1 對象 選擇本院門診1個月到4個月嬰兒217例，隨機分為實驗組113例和對照組104例，跟蹤至12個月。其中實驗組男64名、女49名，對照組男58名、女46名。兩組母親妊娠期無重大疾病，嬰兒為出生體重≥2500g的正常新生兒，排除核黃疸、驚厥及與發(fā)育相關遺傳疾病的新生兒。兩組出生體重和出生情況、家庭環(huán)境等差異無統(tǒng)計學意義。
1.2方法
1.2.1分組方法：采用縱向對照研究的方法，分為實驗組和對照組。
1.2.2實驗組的實施內容
1.2.2.1實驗組由兒保醫(yī)師對其家長進行兒童早期綜合發(fā)展指導：包括兒童系統(tǒng)保健管理、智能發(fā)育指導、撫觸、被動操、親子活動、疾病預防措施及親子教育宣教等。對照組嬰兒進行常規(guī)的兒童系統(tǒng)保健管理。兩組嬰兒均于出生后4至12個月期間接受體重、身長、頭圍測量及智能測試。
1.2.2.2 根據(jù)營養(yǎng)狀況評價結果、體格發(fā)育評價、神經(jīng)精神發(fā)育評估結果及年齡特點進行綜合性早期潛能開發(fā)指導。以鮑秀蘭教授《挖掘兒童潛能始于零歲》為藍本、參照福建省婦幼保健院修訂的“嬰幼兒智能開發(fā)與發(fā)育簡明表”指導家長對新生兒進行視、聽刺激訓練。1個月后到早教和干預門診建立系統(tǒng)檔案，由早教醫(yī)師為每個孩子進行一對一指導，根據(jù)每個孩子的個性特點及不同年齡段的生長發(fā)育特點，通過做體操和用玩具、器材對嬰兒進行感知覺、語言、手功能、大運動及社交能力等方面提供具有個性化的指導意見及適宜的計劃給家長，教會兒童家長實施家庭訓練。
1.2.2.3 每月舉辦一次科學育兒講座，給家長介紹適齡益智玩具、書刊、畫報，普及宣傳常見病的預防知識，接受早期教育的重要性、嬰兒智能發(fā)育規(guī)律及如何開發(fā)嬰兒潛能的知識培訓，并發(fā)給家長健康教育處方。
1.2.2.4 開辦親子園，邀請家長參加每周一次親子活動。親子園主要開展形式多樣、豐富多彩的趣味游戲，培養(yǎng)嬰兒的觀察力、創(chuàng)造力、記憶力、思維能力和社交能力。
1.2.3測量方法：
1.2.3.1智能測驗：兩組嬰兒均于4至12月期間采用首都兒科研究所研發(fā)的“0～6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表”。
1.2.3.2體格生長指標測量：12個月進行體重、身長、頭圍測量。
1.2.4 統(tǒng)計學方法 用SPSS統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析，采用t檢驗，P
1.2.5 質量控制：兩組嬰兒均由一位經(jīng)過正規(guī)培訓、獲得合格證書的醫(yī)生，采用“0～6歲小兒神經(jīng)心理發(fā)育量表”，進行嬰兒智能發(fā)育測驗。
2 結果
嬰兒智能總發(fā)育商和各能區(qū)發(fā)育商的比較：兩組嬰兒總的發(fā)育商，實驗組優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P
3 討論
3.1嬰兒智能發(fā)育是先天遺傳和后天環(huán)境因素相互作用不斷積累的過程，嬰兒智能發(fā)育的水平是由生物學因素、行為特征和家庭環(huán)境質量相互作用決定的。近年來腦科學的發(fā)展和嬰兒心理學的研究進展，為早期綜合發(fā)展奠定了生理和心理方面的理論依據(jù)。腦科學的研究表明，嬰兒期是腦發(fā)育的一個關鍵期，在這一時期按心理發(fā)展年齡為嬰兒提供豐富的各種感官刺激、語言環(huán)境、知覺辨別能力、適應能力及創(chuàng)造動手和身體大動作的機會，充分發(fā)掘大腦潛能，對嬰兒的神經(jīng)心理發(fā)育無疑具有推動作用。因此給予嬰兒提供豐富的感官刺激、語言環(huán)境和適宜的認知能力、社會適應能力等鍛煉，可促進嬰兒的神經(jīng)心理發(fā)育，使腦潛能得到充分的發(fā)揮，從而提高智力水平。
3.2 本研究兩組嬰兒在生物學和環(huán)境因素方面做了較嚴格的對照，條件基本相同。生物學因素方面：研究對象在出生后不久，通過詳細詢問病史和體檢，符合正常足月新生兒標準，嚴格排除圍產(chǎn)期高危因素。出生后到12個月經(jīng)過密切隨診，未發(fā)現(xiàn)嬰兒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其他重大疾病，體格發(fā)育主要指標均正常，因此兩組嬰兒基本上排除了生物學不良因素對智能的影響。而影響嬰兒智能發(fā)育的主要因素，如性別、家庭結構大小、居住環(huán)境兩組相仿均衡，因此兩組智能結果是有可比性。本研究顯示實驗組的發(fā)育商比對照組高，差異有統(tǒng)計學意義，表明早期綜合發(fā)展確實能促進嬰兒智力發(fā)育，與國內其他研究結果一致[1，2]。
3.3 育兒存在的問題：部分家長存在錯誤的育兒觀念：①捆綁肢體限制嬰兒
活動，給嬰兒戴手套，過多抱著嬰兒，不敢讓其有俯臥、翻身、坐爬等活動，束縛了嬰兒探索世界的能力，限制其大運動及精細運動發(fā)展，也容易導致日后感覺綜合失調；②長時間不洗澡、不洗頭，使嬰兒缺乏對水的觸覺感，同時又引起生理上的不舒適感，導致嬰兒產(chǎn)生愛哭、煩躁、不愿與人交流等情緒障礙。③缺少交流，將嬰兒交給保姆、老人，以滿足嬰兒吃喝拉睡的基本需要為限，忽視親子交流、情感的培養(yǎng)。早期綜合發(fā)展是通過科學喂養(yǎng)，有目的的豐富環(huán)境教育活動來促進嬰兒身心全面發(fā)育，根據(jù)嬰兒發(fā)育特點，因勢利導，開發(fā)各種能力，而不是有些家長片面理解的早期綜合發(fā)展就是早教簡單的讓小孩早認字、讀書。
3.4兒童的早期綜合發(fā)展應該以社區(qū)為依托，充分發(fā)揮社區(qū)的資源優(yōu)勢。目前較多社區(qū)仍采用傳統(tǒng)的4：2：1保健體檢模式，這種模式內容僵化單一，提供的資訊極為有限，不能滿足兒童實際的發(fā)展需要。家長對體格發(fā)育、智能評價與指導、親子教育等服務內容的需求較高，而且也對嬰兒撫觸、親子早教課堂等新興的早期教育服務項目表現(xiàn)出很大興趣。但是傳統(tǒng)的社區(qū)兒童保健工作中并未涉及此類更為全面、更有針對性的服務項目，服務的內容與家長需求存在脫節(jié)。本研究通過早期綜合發(fā)展模式，根據(jù)孩子的個體情況采取保教結合，并制定個體化成長計劃，定期進行體格檢查、神經(jīng)心理發(fā)育測查與指導、嬰兒體操等，并為家長開展育兒健康知識講座和親子游戲班，指導家長如何在家中使用益智玩具、親子游戲等早期綜合發(fā)展指導和干預方式。此模式可以因地制宜選取適合當?shù)亻_展的內容在社區(qū)兒童保健工作中推廣使用[3，4]。
參考文獻：
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一、玉米花藥培養(yǎng)研究概況
自1964年印度Guha等從茄科植物毛曼陀羅(Datura innoxia)的離體花藥中成功誘導出單倍體植株以來，這一方法被廣泛應用到28科68屬170多種植物上。我國自1974年初首次成功誘導玉米花粉植株，1977年，廣西玉米研究所與中國科學院植物研究所協(xié)作獲得第一株純合的玉米花粉自交果穗以來，曾一度掀起了玉米花培育種熱潮，許多學者對影響玉米花培反應的各種因素如基因型、花粉發(fā)育時期、培養(yǎng)基等進行了大量研究，也獲得了花培自交系并育成了雜交種應用于生產(chǎn)。如繼谷明光等(1975)誘導出第一批玉米花粉植株之后,杭玲等(1991)先后培育出玉米花培雜交種桂三1號和桂花1號。桂三1號于1992年通過廣西壯族自治區(qū)品種審定,這是國內外用花培方法育成的第一個玉米雜交種。楊憲民(1995)利用玉米花培純系選育出優(yōu)良雜交種花單1號。山東農(nóng)業(yè)大學利用花培單倍體育種技術體系成功地選育出糯玉米雜交種山農(nóng)花糯1號（王啟柏，2002）。北京市植物細胞工程實驗室玉米花培育種課題也取得了可喜的績,獲得了自交系種子（郭奕明，2001）。他們利用育成的玉米花培自交系配制的組合,抗病性強,桿粗穗大，抗倒伏。隨著花藥培養(yǎng)技術的發(fā)展，花培育種已與常規(guī)雜交育種、遠緣雜交育種、誘變育種以及轉基因技術相結合，發(fā)展成一套獨特的育種技術體系?；ㄅ嘤N是生物技術在農(nóng)作物育種應用最廣泛、最有效的方法之一，在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)向高技術農(nóng)業(yè)的轉化中發(fā)揮著紐帶作用，是一種快速有效的育種途徑。
二、影響花藥培養(yǎng)效率的主要因素
1.試驗材料
1.1 供試材料的基因型
基因型是影響花藥培養(yǎng)的主要因素之一。不同基因型的花藥對培養(yǎng)的反應不同。杭玲等（1985）研究發(fā)現(xiàn)，接種不同材料，誘導率差異相當大。在接種的241份雜交組合中，誘導出愈傷組織的材料為212份，占總接種材料的88%，各種材料的誘導率差異幅度為0.02%-100%。何雪銀等（2004）對14份糯玉米材料的花培反應率進行離體培養(yǎng)，有13份材料具有花培反應，占參試材料的92.85%，出愈率在3.16~0.06%；對10份優(yōu)質蛋白玉米材料的花培反應率進行離體培養(yǎng)，有5份具有花培反應，占參試材料的50%，出愈率在0.65~0.11%。這說明在基因組內,可能存在著可調控小孢子發(fā)育的基因。
1.2 供試材料的生理狀態(tài)
供試材料的生理狀態(tài)、植株年齡、植株健壯程度、植株生長發(fā)育的生態(tài)環(huán)境（光照、溫度、大氣濕度）等各方面的因素會直接影響到愈傷組織的形成。谷明光等（1988）認為，取樣日期不同，誘導物產(chǎn)生頻率差異很大。曹孜義等還認為，即使同一天取樣時間不同，誘導率都不同。郭奕明等發(fā)現(xiàn)，生長在大田和溫室中以及在不同季節(jié)里的玉米，在培養(yǎng)過程中誘導頻率都有很大差異，所以應盡量使供體植物的種植標準化。根據(jù)一般經(jīng)驗，在適宜條件下生長的健康植株，其花藥和花粉培養(yǎng)的胚誘導率和植株再生率高。從季節(jié)上看，冬春季較夏秋季更適合進行花藥培養(yǎng)，這可能是溫度與光周期共同作用的結果。
1.3 花粉發(fā)育時期的影響
花粉發(fā)育時期是誘導小孢子分裂的關鍵時期。只有花粉發(fā)育到一定時期的花藥,才對外界刺激敏感。而不同植物的花粉對外界刺激的敏感時期是不同的,如水稻、煙草的花粉,從單核中期到雙核期皆可接受誘導,而玉米的花粉,以單核中后期為佳。此時的玉米花藥長度約4mm,顏色呈淡綠色。
2.培養(yǎng)基成分的影響
2.1基本培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基是花藥培養(yǎng)中影響花粉啟動和再分化的重要條件，培養(yǎng)基對花藥培養(yǎng)的成敗影響很大。在玉米花培的早期,中國科學家對各種基本培養(yǎng)基配方進行了評估(Chu,1981;Ku,1981)。此后,N6、玉培、正14等培養(yǎng)基在玉米中都經(jīng)常用,效果也差不多。1982年，杭玲等用正交試驗方法對培養(yǎng)基的大量元素進行調整試驗，篩選出“82-1”培養(yǎng)基，與N6、正14、玉培等培養(yǎng)基相比，他們認為“82-1”培養(yǎng)基比較適合玉米花藥產(chǎn)生愈傷組織，能使80%的參試材料產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體。杭玲還指出，“82-1”培養(yǎng)基還不是最理想的培養(yǎng)基，要選擇出能廣泛適于各種基因型材料產(chǎn)生更多的愈傷組織或胚狀體的培養(yǎng)基，仍需繼續(xù)做更多試驗。
2.2 培養(yǎng)基的附加物質
2.2.1植物激素 在花藥培養(yǎng)中,調節(jié)激素成分不但可影響花粉發(fā)育類型,而且還可以影響到二倍體的體細胞組織生長增殖。各種研究表明,生長素(特別是2,4-D)和細胞分裂素(特別是KT或BA)的適當比例,能促進孢子體的小孢子發(fā)育。一般誘導培養(yǎng)基用生長素的適宜濃度為2mg/L,而分化培養(yǎng)基用生長素的適宜濃度為0.5mg/L。
2.2.2氨基酸 在培養(yǎng)基中加入適量的氨基酸，如丙氨酸、絲氨酸、L-羥脯氨酸，L-賴氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸等氨基酸，可以促進愈傷組織和胚狀體的發(fā)生。
2.2.3 糖 糖作為培養(yǎng)基中的主要碳源，它不單是調節(jié)滲透壓，對花粉脫分化和再分化產(chǎn)生有利效應。有研究報道，蔗糖濃度在12~15%是花粉脫分化培養(yǎng)基最好濃度，再分化的培養(yǎng)基的蔗糖濃度在5~6%較適宜（王子霞，2001）。
3.預處理的影響
日前，低溫預處理已成為一項廣為采用的提高花藥誘導率的措施。低溫處理時間視使用的溫度而定。較低的溫度處理時間短，較高的溫度處理時間長。典型的玉米花藥處理時間為4~14℃處理7~14d(Nitsch等,1982;Genovesi和Collins,1982;Dieu和Beck2ert,1986,Tsay等,1986)。
4.培養(yǎng)條件
4.1光照
離體花藥對光照的反應是不同的。一般認為,花藥培養(yǎng)在誘導愈傷組織進行暗培養(yǎng)或給以散射光處理比較好。在分化培養(yǎng)期間，在光強為2000Lx，每天光照10個小時為宜。
4.2溫度
培養(yǎng)條件中最主要的是溫度。離體花藥對溫度比較敏感,是誘導小孢子發(fā)育的關鍵因素。研究表明，誘導培養(yǎng)適宜的溫度范圍在25~28℃，分化培養(yǎng)的適宜溫度范圍在23~26℃。
4.3接種密度
由于花藥在培養(yǎng)基上存在營養(yǎng)競爭關系,呼吸代謝等相互作用,因此，接種密度直接影響愈傷組織的誘導頻率和發(fā)育。玉米花藥培養(yǎng)中，每支試管接種30~50枚花藥的接種密度較為合適。
三、花藥培養(yǎng)在育種中應用
1.種質材料創(chuàng)新
利用花藥培養(yǎng)可以克服遠緣雜交的困難。遠緣雜交作為一種育種手段，能引入不同種、屬的有用基因，為改良現(xiàn)有品種提供了一條重要的途徑。然而在遠緣雜交過程中，卻存在著雜交不易成功、雜種一代不育或育性低和雜種后代性狀分離幅度大或“瘋狂”分離，時間長，不易穩(wěn)定三大困難。通過花藥培養(yǎng)，雖然不能解決上述第一困難，但能克服第二、第三種困難。在遠緣雜種的花粉中也有少數(shù)有發(fā)育能力，或者早期是正常的，這可以通過花藥培養(yǎng)，獲得花粉植株，克服上述二者困難。
2.在誘變育種中的應用
花藥培養(yǎng)在誘變育種研究中具有特殊的作用。細胞誘變篩選育種無疑為育種家提供了一條較為便捷的育種途徑。利用體細胞進行誘變篩選，由于體細胞中染色體成對存在，要想使發(fā)生了突變的基因盡快純合并表現(xiàn)出來，還需要經(jīng)過一些自交過程，而利用花藥培養(yǎng)則可以加快誘變突變體的表現(xiàn)進程。如胡忠等、莊承紀等對水稻離體花藥及其花粉植株進行化學誘變或輻射誘變,獲得了早熟、矮桿突變系?；ㄋ幣囵B(yǎng)中獲得變異體的頻率較高,目前在應用各種選擇壓進行誘變并篩選抗寒、抗鹽堿等變異系方面, 都有良好的進展。如鄭祖玲等用稻瘟病病原菌粗提毒素作為選擇壓,將不抗稻瘟病的水稻品種花寒早、桂農(nóng)12等的花藥,接種在有稻瘟病生理小種F1、E3粗毒素的培養(yǎng)基上培養(yǎng),獲得了能抗這2個稻瘟病生理小種的花粉植株株系;Faedi等在培養(yǎng)Pajaro品種的草莓花藥時發(fā)現(xiàn),再生植株中存在無性系變異,所獲得的1484株植株中,36株表現(xiàn)高產(chǎn)、大果和低感病性。
3.在抗病育種中的應用
花藥培養(yǎng)和抗病育種緊密結合,導入抗病基因,是培育抗病品種的有效方法之一。由于二倍體花粉植株來源于單倍體,控制病害抗性的基因已經(jīng)純合,抗、感病特性十分明顯,因而就能很快地將符合育種目標的抗病株系挑選出來,從而育成抗病品種。聶道泰等在中間偃麥草與小麥雜交的衍生材料中發(fā)現(xiàn)“中5”具有中間偃麥草的高抗黃矮病和對條銹病免疫的性狀,因而以“中5”為外源抗性基因供體,通過花藥培養(yǎng),快速創(chuàng)制出穩(wěn)定的小麥條銹病和黃矮病抗性新種質；野生稻ST221抗稻瘟病、感白葉枯病,RBB16則抗白葉枯病、感稻瘟病,而普通栽培稻對2種病都不抗,龐漢華等通過栽培稻與野生稻雜交、花粉植株培養(yǎng),培育出綜合了野生稻親本抗性的野栽稻雜交后代。應用同樣的方法,還可將其它的抗性基因導入到優(yōu)良品種中去。
4.在轉基因育種中的應用
將目的基因轉入單倍體材料,更容易鑒定和篩選具有外源基因的材料。小孢子作為外源基因的受體,可以通過離體培養(yǎng)直接獲得純合的轉基因材料,使目的基因易于表達。與常規(guī)育種、分子育種相結合,拓寬花培育種的應用領域。把分子標記輔助育種與花培技術緊密結合起來,既可以顯著提高培養(yǎng)效率,快速純合植物基因型,盡快獲得純合轉基因植物,同時也擴大了花培技術的應用范疇。
四、存在問題
植物花藥培養(yǎng)研究取得了很大進展,但是在實際應用和擴大花藥培養(yǎng)的基因型范圍方面,還有許多工作要做。
1.誘導頻率和分化成苗率低
對于多數(shù)植物來講,能形成有活力胚的花藥百分率很低。通?；ㄋ幓蚧ǚ垭x體培養(yǎng)時沒有生長和發(fā)育跡象,或剛開始生長便導致胚敗育,大量畸形胚狀體出現(xiàn),愈傷組織分化能力低,白化苗難以避免，因此，難以獲得足夠的選擇群體而嚴重限制了該技術在育種實踐中的應用。因此,大幅度提高玉米花藥培養(yǎng)效率,獲得大量的加倍純系,是目前玉米花藥培養(yǎng)育種中急需解決的問題。
2.培養(yǎng)方法沒有達到普遍的最優(yōu)化
培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件間相互作用關系不清楚，胚狀體或愈傷組織的誘導率和分化率較低，不定芽生長能力差，結果造成成苗率低，植物再生周期長，白化苗增多等，這些尚有待進一步深入研究，以建立玉米花藥培養(yǎng)的最適體系。
3.花藥培養(yǎng)易受到體細胞的干擾
在花藥培養(yǎng)過程中，花藥壁、絨氈層組織會不可避免地通過愈傷組織階段形成胚狀體。目前主要通過提高蔗糖濃度，減少或不用2，4-D來誘導花粉愈傷組織，而采用NAA和6-BA配合使用來避免體細胞對花藥培養(yǎng)的干擾，但對一些植物種類效果不明顯，沒有從根本上解決問題，這給染色體倍性鑒定帶來了麻煩，所以如何有效的控制體細胞干擾，需要進一步的研究。
總之，花藥培養(yǎng)技術是迄今為止創(chuàng)造純合基因型的最有效手段之一，加強花藥培養(yǎng)體系中關鍵技術和遺傳機理的研究，使花藥培養(yǎng)與基因工程相結合，解決花藥培養(yǎng)對基因的依賴性，提高花藥培養(yǎng)效率，將為花藥培養(yǎng)的應用開創(chuàng)一個新的局面。
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關鍵詞：高級微生物學；碩士研究生；教學改革
中圖分類號：G642.0 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2016）01-0154-02
研究生的培養(yǎng)不同于本科生，按教育部下發(fā)的《關于深化研究生教育改革的意見》（教研1號）所說，培養(yǎng)高層次人才的主要途徑是研究生教育，它是國家創(chuàng)新體系的重要組成部分。該意見要求在研究生學習階段，課程學習和科學研究要有機結合，強化培養(yǎng)學生的創(chuàng)新能力。高級微生物學是生物科學與工程學院生物工程專業(yè)學位研究生和微生物學學術型研究生必修的一門課程，是微生物學理論和實踐相結合的一門課程，在研究生的課程中，具有舉足輕重的作用。隨著現(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展，新理論、新材料、新方法、新技術的不斷推廣應用，《高級微生物學》課程的教學內容也逐步變化，舊的理論、實驗設備及實驗方法有些已淘汰，新的已經(jīng)補充。為了使研究生及時了解本學科國內外的發(fā)展現(xiàn)狀與動態(tài)，提高其從事科學研究、教學與科技管理、指導生產(chǎn)實踐的能力，本教學團隊在多年的教學基礎上，對研究生的“高級微生物學”課程進行了改革探索。主要針對教學內容、教學方法、考核方式等方面進行了改革，努力提高教學質量，積極培養(yǎng)研究生的創(chuàng)新能力。
一、修訂教學大綱，優(yōu)化教學內容
江西農(nóng)業(yè)大學1957年創(chuàng)建了微生物學科，國內知名學者黃其望、歐陽諒等老前輩創(chuàng)建本學科。半個多世紀歷經(jīng)幾代人的辛勤耕耘，微生物學科得以發(fā)展壯大。2003年本學科經(jīng)教育部批準為碩士點，開始招收微生物學專業(yè)碩士研究生，而“高級微生物學”一直被列為微生物學專業(yè)碩士研究生的一門重要專業(yè)核心課程，該課程沒有固定教材，講授相關領域的最新研究進展是主要的教學內容，同時設定一定學時的討論課。隨著研究生擴招，研究生掌握的微生物學基礎知識參差不齊。為了使研究生的微生物學基礎知識得以強化，為了拓寬研究生的知識背景，“高級微生物學”課程以周德慶主編的“微生物學教程”和沈萍主編的“微生物學”為主要教材，教師講授部分內容，學生自學部分內容。
根據(jù)學科發(fā)展和進步及時修訂和完善教學大綱，新的教學內容分幾個部分：
（1）簡要介紹微生物學發(fā)展史，微生物研究與發(fā)展現(xiàn)狀，鞏固本科學習階段的內容，夯實研究生學習高級微生物學的基礎；
（2）根據(jù)微生物的特點，沿著微生物的形態(tài)結構、生長發(fā)育、新陳代謝、代謝調控等基本理論主線，闡述微生物資源開發(fā)利用和學科的最新成就；
（3）圍繞微生物學基本技術和最新的技術方法，從微生物生態(tài)學研究與應用實踐，微生物的分類與鑒定兩方面講解。
教師在授課過程中，要盡量結合科研和生產(chǎn)的實例，闡明微生物學現(xiàn)代技術方法、原理和應用，使學生掌握科學研究應具備的科研思路和常用的微生物學技術，引導學生在科研設計和實驗中去提出問題，分析問題和解決問題。教師在結合國內外微生物學科的一級期刊以及Science、Nature等雜志上新近發(fā)表的微生物學相關研究成果授課過程中，讓學生了解微生物學領域中的源頭創(chuàng)新及科學效應，及時更新教學內容，使教學內容與時展保持同步。
二、改革教學方法，培養(yǎng)學生創(chuàng)新能力
大多數(shù)研究生認為研究生學習期間關鍵是要把實驗做好，課程的學習不重要，學習目的不明確，學習態(tài)度不積極，所以經(jīng)常有大量的學生缺課。有的研究生為了獲取學分，不是深入探索學習相關知識，而是通過考試前死記硬背一些考試內容過關。如果老師要求寫文獻綜述，很多學生為了完成任務，就在網(wǎng)上收集一些論文資料，不做任何分析，敷衍了事。研究生教育要求學生不但知識背景要寬泛，而且要有扎實的基礎理論和專業(yè)知識，要達到這種目的必須是通過課堂教學而不是通過實驗完成。因此我們試圖改變教學方法，提高學生學習興趣。我們將理論教學分解為精講部分、講座部分、自學討論三個部分。把以教師為中心變?yōu)橐詫W生為主體，充分發(fā)揮教師的引導作用和學生的主觀能動作用。首先布置課前文獻報告，再組織課堂交流，討論文獻相關問題，最后監(jiān)督討論后的研究報告和進程，把知識灌輸改變?yōu)橐灾匾暷芰ε囵B(yǎng)為目的的傳授知識。通過探究式、激發(fā)式教學方式，提高教學水平，培養(yǎng)研究生創(chuàng)新能力和創(chuàng)新意識。
三、開展專題演講，鍛煉學生綜合能力
完成理論基礎知識的講解部分內容后，給每個學生設立一個主題，如重金屬的微生物代謝研究進展、微生物來源天然產(chǎn)物的生物合成和組合生物合成、微生物代謝組學、細菌的信息交流、環(huán)境微生物基因組學、土壤微生物生態(tài)工程、微生物蛋白組學、未能培養(yǎng)微生物、新基因發(fā)掘和功能研究、農(nóng)用抗生素的研究等，要求學生結合自己將來的研究工作進行選題。學生可利用互聯(lián)網(wǎng)、圖書館查閱文獻資料綜合分析，寫成5000字左右的綜述（不含參考文獻），制作PPT，安排一定的課時要求學生輪流上臺演講，其他學生和老師作為評委，根據(jù)其幻燈片制作是否精美、語言表達是否流暢、內容是否條理清晰、回答問題是否恰當?shù)戎笜藶檠葜v的同學綜合評分。研究生通過這些新知識的學習，開闊了的學習視野，啟發(fā)了思維，強化了學術研討和文獻調研的能力，奠定了科研課題研究工作的基礎。
四、增設實驗環(huán)節(jié)，增強學生實踐能力
由于招生規(guī)模逐年擴大，研究生生源多樣化明顯。不同的生源掌握的微生物學實驗技術差別明顯，新生現(xiàn)狀給研究生教學提出了新的挑戰(zhàn)。由于是第一學期開設高級微生物學課程，很多學生尚未進入實驗室，為了培養(yǎng)研究生嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度和持之以恒的科學精神。我們在課程改革中增設了實驗環(huán)節(jié)。在實驗安排中，首先設計的是一些基礎性的實驗，如，土壤中好氧微生物的分離、純化及無菌操作技術；細菌與酵母、放線菌與霉菌的菌落特征識別；普通光學顯微鏡的使用與放線菌染色技術及其形態(tài)和結構觀察。隨后根據(jù)學生將來的研究方向選題，設計實驗方案，在老師指導下開展實驗。例如微生物次級代謝產(chǎn)物研究方向的研究生，我們確定的題目是“放線菌發(fā)酵培養(yǎng)物對土壤及植株養(yǎng)分的影響”通過實驗了解不同濃度的鏈霉菌代謝產(chǎn)物處理水稻種子，對種子萌發(fā)率、可溶性糖、葉綠素含量及根系活力的變化進行綜合分析；以稻瘟病菌為病原菌對三葉一心期的水稻進行處理，以觀察鏈霉菌對水稻幼苗抗病效應的影響。通過這個創(chuàng)新實驗環(huán)節(jié)，一方面提高了不同生源學生的實驗操作技能，另一方面培養(yǎng)了學生的學習主動性，同時，學生的團隊協(xié)作精神也得到了提升。
五、規(guī)范考核模式，強化基礎知識，考查思維創(chuàng)新
研究生課程考核模式主要有三種，提交課程論文、開卷考試和閉卷考試等。但這些考核方式均存在弊端，如課程論文，學生只是在網(wǎng)上拷貝現(xiàn)有的論文，不做任何的歸納總結。開卷考試則是學生把試卷拿回去，在網(wǎng)上搜索相關答案直接照搬照抄。閉卷考試時，學生就在考試前突擊，死記硬背?？偨Y經(jīng)驗，我們對高級微生物課程成績的最終評定做了許多調整，量化各項指標。我們將考核內容設定為考勤5%+課堂交流25%+課外作業(yè)15%+期末考試55%，考勤考查的是到課率，課堂交流包括課堂問題的交流和由學生選定的專題演講，課外作業(yè)為布置的每章節(jié)的作業(yè)，期末考試主要是討論型的題型。增加平時成績和討論分析題型的比例，可以有效避免學生考前突擊，考后就忘的現(xiàn)象，引導學生真正地用腦學習。
為了順應現(xiàn)代生物技術的飛速發(fā)展，教師不僅要有寬泛的生命科學理論知識，而且其技術知識層次也要跟上現(xiàn)代生物實驗技術不斷更新的步伐。因此我們在研究生的高級微生物學教學過程中，隨時關注高水平期刊文獻，更新補充知識，及時引導學生密切關注最新的研究。教師從學習者實踐體會方面得到寶貴信息和教學資源，促進了知識結構的不斷更新，提高了教學水平，有效地實現(xiàn)了教學相長。
國內許多生物相關專業(yè)院校都開設了《高級微生物學》課程，各院校在教學內容組織、教學方法和手段、學生實踐等方面各有所長，有許多值得我們學習和參考的做法。例如南京農(nóng)業(yè)大學充分利用英文原版教材提供的課程網(wǎng)站、各類多媒體技術等教學手段，提高教學信息質量，關注前沿動態(tài)和最新科研成果，采用雙語教學試點部分教學內容、建立網(wǎng)絡交流平臺的做法值得我們學習。當然在進行課程改革的過程中，會遇到一些問題，如在安排課程實驗時，需要課時的保證和實驗場地，由此影響了原來的教學安排，這就需要協(xié)調實驗室和師資安排。我們將進一步探討課程改革的可行性，盡可能地完善高級微生物課程教學模式，促進研究生研究性、自主性學習，完善知識背景和提升研究能力。
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關鍵詞：妊娠高血壓疾病 發(fā)病學 研究進展
中圖分類號：R711 文獻標識碼：A 文章編號：1004-7484（2012）10-0222-03
母親安全、兒童優(yōu)先是圍生醫(yī)學永恒的主題。該主題的初級目標是降低孕產(chǎn)婦和圍生兒死亡率，中期目標是降低母嬰發(fā)病率和殘疾率，終期目標是提高人口素質[1]。
妊娠期高血壓疾病的發(fā)病學及機制的不清目前仍然困擾著全球產(chǎn)科。由該病引起的孕產(chǎn)婦及圍生兒的死亡率和并發(fā)癥也一直威脅著女性健康。由于現(xiàn)代實驗方法的進步，在研究過程中發(fā)現(xiàn)了很多與妊娠高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展相關的因子，從而建立了許多學說，本文從以下幾個方面來綜述：
1 發(fā)病學研究的概述
盡管妊娠高血壓疾病的病因研究已有100多年的歷史，通過無數(shù)學者不懈的努力但至今仍未很清楚的闡明。其病理生理學改變廣泛而復雜，包括全身血管痙攣、凝血系統(tǒng)的激活及止血機制異常，前列環(huán)素與血栓素比值的改變等。這些異常的改變導致多器官系統(tǒng)血管的病理損害（如腎、肝、心、腦及子宮胎盤血管床），結果可引起胎兒生長遲緩、死胎、早產(chǎn)、圍產(chǎn)期窒息，孕婦也容易并發(fā)胎盤早剝、抽搐、顱內出血、肺水腫及肝腎功能衰竭等。近年來，隨著醫(yī)學基礎理論特別是分子生物學的研究進展，使妊娠高血壓疾病從發(fā)病學的研究到病理生理變化取得了新的突破。
2 發(fā)病學研究的機制與學說
2.1胎盤或滋養(yǎng)葉細胞缺血學說：
早在1918年，Young首先提出子宮缺血學說，其支持理由在于妊娠高血壓疾病多發(fā)生于：（1）子宮內壓增高的患者；（2）合并有全身血管病變的孕婦；（3）先天性動脈發(fā)育畸形的患者。以后通過許多學者的實驗證明，子宮—胎盤缺血學說獲得公認。后來又從葡萄胎可并發(fā)妊娠高血壓疾病的現(xiàn)實得到啟示，胎盤缺血關鍵可能在于滋養(yǎng)葉細胞缺血。
滋養(yǎng)葉細胞缺血與早孕期子宮胎盤血管床發(fā)育受阻有關。提示早孕期滋養(yǎng)葉細胞缺氧，可能是導致子宮胎盤血管床發(fā)育受阻的重要原因。目前又稱這種病理現(xiàn)象為胎盤淺表著床或缺陷胎盤。
2.2高同型半胱氨酸血癥與血管內皮損傷學說：
近年來，動物試驗證實，高同型半胱氨酸血癥可誘發(fā)孕鼠產(chǎn)生妊娠期高血壓疾病的典型改變[2]。因此，目前高同型半胱氨酸是妊娠期高血壓疾病發(fā)病學研究的熱點。高同型半胱氨酸可能導致妊娠期高血壓疾病的機制：高同型半胱氨酸促進氧自由基的生成，使氧化還原系統(tǒng)平衡失調，呈現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，導致血管內皮細胞受損，繼而引發(fā)小動脈痙攣等一系列病理生理改變，符合妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機制[3]，動物試驗通過給予蛋氨酸負荷至Wistar大鼠形成高同型半胱氨酸動物模型顯示，血漿一氧化氮濃度較試驗前明顯降低，證實了高同型半胱氨酸血癥對血管內皮功能的損害作用[4]。高濃度的同型半胱氨酸及其產(chǎn)生的過氧化物超過了細胞的清除能力，破環(huán)了細胞的防御性保護反應,導致內皮細胞損傷。實驗研究發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血管內皮損傷的特殊標志物：血管內皮損傷因子[5]，血管細胞粘附因子21，纖維結合素[6]，均生成增加[7]。研究還表明，早發(fā)型重度子癇前期患者血清同型半胱氨酸顯著高于晚發(fā)型重度子癇前期組及正常妊娠組[8]。所以，研究證明了高同型半胱氨酸在妊娠期高血壓疾病內皮細胞損傷中起著很重要的作用。目前認為，血管內皮具有多種重要的生理功能。一旦血管內皮受損可導致血管通透性增加，體液與旦白升高，抗凝血因子和血管擴張因子減少，在受損部位引發(fā)促凝血因子合成和激活凝血系統(tǒng)，最終導致血小板凝聚及血栓形成并釋放有絲分裂元，其中主要的有血小板衍生生長因子，這是一種很強的血管收縮因子。因此，血管內皮損傷是目前提出普遍公認的妊娠高血壓疾病的主要發(fā)病機理。
2.3免疫學說：
從免疫學角度看來，胚胎是一半同種異體移植物，妊娠成功有賴于胎兒——母親間的免疫平衡，而這種平衡一旦失調，就可能引發(fā)排斥反應，導致病理妊娠，如妊娠高血壓疾病。目前支持妊娠高血壓疾病與排斥反應有關的證據(jù)主要是，患者子宮螺旋小動脈存在著類似于腎移植排斥反應所出現(xiàn)的典型的血管炎病變，即螺旋小動脈急性粥樣硬化。這一點為過去和近年來國內外研究反復證實。
2.4遺傳學說：
從臨床觀察，妊娠高血壓疾病存在著明顯的遺傳傾向，即有妊娠高血壓疾病家族史的孕婦，妊娠高血壓疾病發(fā)病率明顯高于無家族史的孕婦。
從分子學水平對本病進行探討發(fā)現(xiàn)，采用血清學方法檢測，妊娠高血壓疾病患者白細胞抗原（HRA）DR4頻率明顯增高。PCR和地高辛標記寡核苷酸探針雜交技術，探查H41—DRB1基因座位，也證實妊娠高血壓疾病HLA—DR4抗原頻率增高和母親、胎兒HLA—DR4抗原相容性增加有關，同時還發(fā)現(xiàn)等位基因0405基因頻率也明顯增加。這些表明，妊娠高血壓疾病至少與HLA—DR4相關。妊娠高血壓疾病分子遺傳學的研究，還有待深入。
[關鍵詞] 半夏曲； 發(fā)酵； 優(yōu)勢菌種； 16S rDNA和26S rDNA； 系統(tǒng)發(fā)育樹； 菌種鑒定
半夏曲是臨床上常用的中藥炮制品之一，為清半夏、六神曲、生姜汁、面粉、白礬發(fā)酵而成。半夏曲含有酵素等， 具有祛濕化痰、降逆止嘔、健脾溫胃的功能， 用于治療心下痞滿， 不欲飲食， 倦怠乏力， 大便不調[1]。半夏曲的現(xiàn)代研究側重處方篩選、化學成分等，對于半夏曲炮制中起重要作用的微生物研究甚少。目前，僅蔡清宇等[2]初步表明生半夏曲中含較多雜菌，在血平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)出革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性桿菌及球菌，在沙氏培養(yǎng)基中未培養(yǎng)出真菌。本實驗對半夏曲發(fā)酵炮制過程中不同時間點的微生物菌群種類和數(shù)量變化進行初步研究，并分離鑒定優(yōu)勢菌種，研究結果將為揭示半夏曲炮制機制奠定基礎。
1 材料
1.1 儀器
MILLIQ超純水儀（美國Millipore公司）；培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；PTC200 PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析儀（美國伯樂公司）；I16K高速低溫離心機 （Sigma公司）。
1.2 試劑
硫酸鏈霉素、瓊脂粉、溶菌酶購自北京索萊寶；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡糖糖瓊脂購自青島海博，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（自配）；植物基因組DNA提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、酵母菌基因組DNA提取試劑盒、2×Taq PCR master Mix購自北京天根；溶菌酶緩沖液、PCR引物購自上海生工；瓊脂糖購自Innvitrogen公司；DM2000 Marker購自康為世紀公司。
1.3 供試樣品
半夏曲炮制過程中不同時間點樣品由成都中醫(yī)藥大學提供。
1.4 引物
細菌16S rDNA基因通用引物序列，27F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3′；1492R：5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。真菌26S rDNA基因通用引物序列[3]，NL1： 5′GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA G3′；NL4： 5′GGTCCGTGTTTCAAGACGG3′。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。
2 方法
2.1 半夏曲的制備（由成都中醫(yī)藥大學制備）
參照中藥部頒標準。清半夏 160 g、白礬 10 g、 六神曲 5 g、生姜汁20 g、面粉 32 g，除生姜汁、面粉外，其余3味粉成細粉；生姜汁加水適量，與面粉及上述細粉攪勻，制成粗粒軟硬適宜的小塊或顆粒，發(fā)酵，干燥。分別取發(fā)酵0，18，36，54，72 h的樣品于無菌的密封袋中4 ℃保存，并在3 d內完成不同種微生物的培養(yǎng)計數(shù)。
2.2 微生物的培養(yǎng)及菌落計數(shù)
取5個炮制時間點的樣品各1 g于無菌的小錐形瓶中，加入9 mL的無菌生理鹽水在水平搖床搖勻，取配好的樣液1 mL加入9 mL的無菌生理鹽水，依次進行梯度稀釋為1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9，根據(jù)不同取樣點的樣品菌落數(shù)選取合適的3個稀釋梯度（1×10-1，1×10-2，1×10-3）。取100 μL稀釋液注入平皿固體培養(yǎng)基上，用涂布器涂布均勻，每個稀釋度做3個重復。細菌培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～2 d。霉菌和酵母菌培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 d。菌落的計數(shù)公式：每1 mL原菌液活菌數(shù)=同一稀釋度3個平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×10。
2.3 優(yōu)勢菌種的分離純化
挑選各樣品培養(yǎng)皿中的細菌、霉菌、酵母菌菌落，取菌落形態(tài)相似且出現(xiàn)頻率多的微生物作為優(yōu)勢菌種進行分離純化（盡可能多挑出形態(tài)不同的菌落）及形態(tài)學觀察。將純化后的單一菌落置于無菌EP管中保藏于4 ℃ 冰箱并盡快進行分子生物學的鑒定。
2.4 優(yōu)勢菌種的鑒定
2.4.1 優(yōu)勢細菌的鑒定 將保存的優(yōu)勢細菌傳代培養(yǎng)，刮取菌苔用細菌基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，采用細菌16SrDNA的通用引物27F/1492R進行擴增。PCR反應體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，補充ddH2O至25 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。取2 μL的擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖上進行凝膠電泳，使用瓊脂糖凝膠拍照系統(tǒng)檢測擴增產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物送至上海生工進行測序。測序結果使用Biodit軟件打開，將測序結果復制于NCBI網(wǎng)站上使用Blast進行同源性比較，下載同源性較高的序列采用MEGA 4.0軟件的NeighborJoining方法，1 000 次 Bootstrap檢驗后構建系統(tǒng)發(fā)育樹。
2.4.2 優(yōu)勢真菌的鑒定 將保存的優(yōu)勢真菌菌株傳代培養(yǎng)，刮取菌苔，分別用酵母菌基因組DNA、植物基因組DNA提取試劑盒提取不同發(fā)酵時間點的優(yōu)勢酵母菌和霉菌的DNA，采用真菌26S rDNA的通用引物NL1/NL4進行擴增。PCR反應體系：模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR master Mix 2 μL，補充ddH2O至25 μL。反應程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。其他同2.4.1。
3 結果與分析
3.1 半夏曲發(fā)酵過程中微生物種類、數(shù)量變化及優(yōu)勢菌種形態(tài)學觀察
在半夏曲炮制過程中，從發(fā)酵0 h至發(fā)酵72 h，細菌數(shù)量少且呈緩慢增長趨勢；酵母菌在發(fā)酵前期數(shù)量偏少且變化不明顯，發(fā)酵至54 h時數(shù)量急劇增加，至發(fā)酵結束時達1×107.78 CFU?mL-1，在發(fā)酵前期并未出現(xiàn)霉菌，然而發(fā)酵至54 h時霉菌數(shù)量迅速升高1×106.91 CFU?mL-1，至發(fā)酵結束時與酵母菌數(shù)量相差無幾（表1，圖1）。5個不同發(fā)酵時間點樣品共挑選出27株優(yōu)勢菌，其中細菌11株，酵母菌9株，霉菌7株，菌落顏色為白色和黃色，對優(yōu)勢細菌進行形態(tài)學觀察及革蘭氏染色，大多為革蘭氏陽性桿菌；對優(yōu)勢酵母菌鏡檢可觀察到明顯的出芽，對優(yōu)勢霉菌鏡檢可觀察到菌絲和孢子。
3.2 優(yōu)勢菌種的分子生物學鑒定
從半夏曲發(fā)酵過程中的5個不同時間點共分出27株優(yōu)勢菌株，采用16S rDNA，26S rDNA序列分析、相似性比對及構建系統(tǒng)發(fā)育樹分別對優(yōu)勢細菌、真菌進行鑒定。AaX1為Streptomyces sp.（鏈霉屬）；AaX2為Staphylococcus epidermidis（表皮葡萄球菌）；AaX3，DdX2為Bacillus pumilus（短小芽孢桿菌）；AaX4，BbX2，BbX4，EeX1為Bacillus sp.（芽孢桿菌屬）；BbX1，DdX1為B. subtilis（枯草芽孢桿菌）；BbX3為B. aryabhattai（阿氏芽孢桿菌）。AaJ1，AaJ2，AaJ3，BbJ1，BbJ2，DdJ1，DdJ2，DdJ3，DdJ4為Meyerozyma guilliermondii（季也蒙畢赤酵母菌）；375J，375M為Paecilomyces variotii（宛氏擬青霉）；3100J，3100M為Byssochlamys spectabilis（絲衣霉菌）；EeX2，F(xiàn)fX1，F(xiàn)fX3為Aspergillus niger（黑曲霉）（表2，圖2，3）。
4 討論
目前關于半夏曲發(fā)酵過程中的微生物研究極少，對于菌種的鑒定也只是粗略的歸類。本文首次研究半夏曲發(fā)酵過程中不同時間點的微生物種類和數(shù)量變化及其優(yōu)勢菌種進行分子生物學鑒定。研究發(fā)現(xiàn)半夏曲發(fā)酵過程中細菌數(shù)量少、變化平緩，而酵母菌和霉菌數(shù)量發(fā)酵至54 h時迅速增加，至發(fā)酵結束時達1×107 CFU?mL-1以上；優(yōu)勢菌株的鑒定為優(yōu)勢細菌Streptomyces sp.，B. pumilus，B. subtilis，B. aryabhattai以及其他的Bacillus sp.，優(yōu)勢酵母菌M. guilliermondii，優(yōu)勢霉菌P. variotii， B. spectabilis， A. niger。結合菌落計數(shù)與分子生物學鑒定結果，推測發(fā)酵54， 72 h時酵母菌的選擇性培養(yǎng)皿上分離出的是霉菌，可能在發(fā)酵前期酵母菌利用面粉中的淀粉質迅速繁殖，中后期淀粉質減少酵母菌的數(shù)量也逐漸減少。
霉菌在發(fā)酵中能產(chǎn)生各種蛋白質酶以及α淀粉酶，A.niger還能產(chǎn)酸性脂肪酶和有機酸[45]。A.niger，M.guilliermondii能產(chǎn)生菊粉酶，菊粉酶是一種微生物酶?，F(xiàn)在已知的能產(chǎn)菊粉酶的微生物主要有A.niger，A.ficuum，A.Phoenicis，Pichia sp.，Debaryomyces cantarellii，Athrobacter sp.，Clostridium acetobutylicum[67]。菊粉酶的水解產(chǎn)物低聚果糖是雙歧桿菌的增殖因子，它能抑制有害菌的增長，調節(jié)胃腸道的功能；降低膽固醇和血脂，改善脂質的代謝，促進礦物質的吸收以及纖維素的合成等[8]。P.variotii能產(chǎn)木聚糖酶，木聚糖酶能促進蛋白酶、淀粉酶等水解酶的釋放，提高發(fā)酵效率，廣泛用于酒類的釀造[910]。Bacillus sp.具有很強的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶活性，它能產(chǎn)生纖維素酶將半夏曲中的植物類原料細胞的細胞壁破壞，促使細胞中的營養(yǎng)物質釋放出來。B.spectabilis在發(fā)酵中的相關研究較少，對于其具體的酶學性質還有待進一步的研究。將半夏曲與生半夏、法半夏、姜半夏比較時發(fā)現(xiàn)只有半夏曲具有消食化積的作用，這可能與半夏曲發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生的蛋白質酶、淀粉酶、脂肪酶、菊粉酶等有關。本研究首次對傳統(tǒng)曲類中藥半夏曲不同發(fā)酵時間點的優(yōu)勢菌株進行了分離鑒定，為揭示半夏曲的炮制機制奠定了基礎。
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